nt (泳道5); 13nt/21nt (泳道6) ;14nt(a)/21nt (泳道 7) ;14nt(b)/21nt (泳道8) ;15nt/21nt (泳道9)， 进行转染。在转染后48小时收获细胞。通过蛋白质印迹测定β-联蛋白的表达。E2F1和 肌动蛋白用作对照。
[0093] 图4和5显示含或不含碱基置换的aiRNA寡聚物在介导基因沉默中的结构-活性 关系。用所示aiRNA转染Hela细胞。在转染后48小时时收获细胞并且产生裂解物。执行 蛋白质印迹以检测β-联蛋白和肌动蛋白的水平。si表示β-联蛋白siRNA寡核苷酸。每 个泳道上方的数字标记对应于表3中的aiRNA寡聚物。
[0094] 图6显示对aiRNA触发的基因沉默的机制的分析。
[0095] 图6a显示在用aiRNA或siRNA转染所示天数的细胞中β -联蛋白mRNA水平的 RNA印迹分析。
[0096] 图6b显示β -联蛋白的5 ' -RACE-PCR示意图，显示mRNA切割和预期的PCR产物。
[0097] 图6c显示从用aiRNA转染4或8小时的细胞通过5' -RACE-PCR扩增由aiRNA介 导的β-联蛋白切割产物。
[0098] 图6d显示通过测序5' -RACE-PCR片段验证的β -联蛋白mRNA切割位点的示意 图。
[0099] 图6e显示aiRNA和siRNA的差异RISC装载效率。在用pCMV_Ago2转染后48小 时，将aiRNA或siRNA双链体转染到Hela细胞内。在aiRNA或siRNA转染后于所示时间点 将Ag 〇2免疫沉淀，并且执行RNA印迹分析以测定与Ag〇2/RISC结合的小RNA的水平。在IP 后通过蛋白质印迹测定Ag〇2的水平（显示在下方）。
[0100] 图6f显示敲低Ago2或Dicer对aiRNA和SiRNA的基因沉默活性的影响。用 scramble siRNA(siCon)、或革巴向 Ago2(siAgo2)或 Dicer(siDicer)的 siRNA 转染细胞 24 小时后，用 scramble aiRNA(Con)或革El向 Stat3 的 aiRNA(ai)转染。在 aiStat3 转染后 48 小时收获细胞，并且执行蛋白质印迹分析。
[0101] 图7显示与SiRNA比较，aiRNA掺入RISC内的优势。
[0102] 图7A显示aiRNA比siRNA更有效地进入RISC。转染了 Ago2表达质粒的细胞用 aiRNA或siRNA转染所示时间。在细胞裂解后，将Ag〇2免疫沉淀，从免疫沉淀物中提取RNA， 并且在15 %丙烯酰胺凝胶上分离。在转移后，使膜与探针杂交，以检测aiRNA或siRNA的 21mer反义链。IgG对照泳道显示与Ago2免疫沉淀物相比缺乏信号。
[0103] 图7B显示aiRNA的有义链不停留在RISC中。剥离（A)的膜上的探针，并且重新用 探针探测，以检测转染的寡聚物的有义链。（A)和（B)中的卡通图说明有义链（上方链）、 反义链（下方链）或双链体在膜上的位置。
[0104] 图8显示通过aiRNA的RISC装载机制。
[0105] 图8A显示对aiRNA或siRNA的不同链和Ago2之间的相互作用的免疫沉淀分析。包 含超表达的Ago2的Hela S-IO裂解物与包含32P末端标记的有义链或反义链的所示aiRNA 或siRNA双链体一起温育。（*)号标明该标记物的位置。在Ag〇2免疫沉淀后，分离RNA并 且在15%丙烯酰胺凝胶上分离，对胶片进行曝光。与Ag 〇2结合的RNAs显示在沉淀级分中， 而未与Ago2结合的RNA保留在上清液（Sup)中。
[0106] 图8B显示有义链切割在aiRNA活性中的作用。用aiRNA、或用有义链在位置8(预 测的Ag 〇2切割位点）或位置9 (作为对照）处具有2' -0-甲基的aiRNA，转染细胞。在转 染后4小时收集RNA，并且执行qRT-PCR，以测定剩余的β -联蛋白mRNA的相对水平。
[0107] 图9显示aiRNA和siRNA竞争分析。
[0108] 图9A示例包含32P末端标记的反义链的siRNA和aiRNA双链体。（*)号标明该标 记的位置。
[0109] 图9B显示冷aiRNA不与标记的siRNA竞争Ago2。包含超表达的Ago2的Hela S-IO 裂解物与32P末端标记的siRNA及冷aiRNA或siRNA双链体一起温育，之后免疫沉淀Ag〇2。 随后分离RNA，并且在15%丙烯酰胺凝胶上分析。
[0110] 图9C显示冷SiRNA不与标记的aiRNA竞争Ago2。将与B中所用相同的S-IO裂解 物与 32P末端标记的aiRNA及冷aiRNA或siRNA双链体一起温育，之后免疫沉淀Ag〇2。随 后分离RNA，并且在15%丙烯酰胺凝胶上分析。
[0111] 图10示例aiRNA和SiRNA的模型，显示了在RISC装载和成熟RISC产生中观察到 的差异。
[0112] 图11显示具有反义突出端的14_15bp不对称RNA双链体（aiRNA)诱导了有力、有 效的、快速且持久的基因沉默。
[0113] 图IlA为显示靶向β-联蛋白的siRNA和aiRNA的序列和设计的示意图。
[0114] 图IlB显示由各种长度的aiRNA诱导的基因沉默。在用所示aiRNA转染48小时 的细胞中，通过蛋白质印迹分析β -联蛋白的蛋白质水平。
[0115] 图IlC显示aiRNA在诱导β-联蛋白的蛋白质耗竭方面比siRNA更有力和有效。 用靶向β -联蛋白的aiRNA或siRNA以所示浓度转染Hela细胞。在转染后48小时，制备 细胞裂解物并且进行蛋白质印迹分析。
[0116] 图IlD显示aiRNA在减少β -联蛋白的RNA水平方面比siRNA更有效、快速和持 久。细胞用IOnM 15bp aiRNA或21-mer siRNA转染所示天数后，进行RNA印迹分析。
[0117] 图12显示aiRNA介导快速且有力的沉默。
[0118] 图12A显示用于靶向β -联蛋白的aiRNA和siRNA的序列和结构。
[0119] 图12B显示对来自转染了对照aiRNA或靶向β -联蛋白的aiRNA的细胞的β -联 蛋白mRNA的水平进行的RT-PCR。在转染后于所示时间收集RNA。
[0120] 图12C显示在用对照、aiRNA或siRNA转染所示小时数的细胞中对β -联蛋白的 mRNA水平的定量实时RT-PCR。
[0121] 图12D显示在用对照、aiRNA或SiRNA转染所示时间的细胞中对β -联蛋白的蛋 白质水平的蛋白质印迹分析。
[0122] 图13显示aiRNA与SiRNA在针对多种靶的基因沉默功效和持久性方面的比较。 用 scrambled siRNA(c)、革巴向（a) β-联蛋白（以 IOnM)、（b)Stat3、（c)EF2、或（d)NQOl (以 20nM)的aiRNA(ai)或siRNA(si)转染Hela细胞。在所示时间点纯化RNA和蛋白质，并且 通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR)分析mRNA水平，和通过蛋白质印迹分析蛋白质水 平。相对于SiCon转染的细胞，标化qRT-PCR数据。
[0123] 图14显不aiRNA介导的基因丨几默在多种细胞系中对各种基因是有效的。
[0124] 图14a显示在不同哺乳动物细胞系中aiRNA双链体比SiRNA更有效地靶向β -联 蛋白。
[0125] 图14b显示来自用20ηΜ所示aiRNA或siRNA转染48小时的细胞的NbsU存活蛋 白、Parpl、p21的蛋白质印迹分析。
[0126] 图14c显示来自用20nM所示aiRNA或siRNA转染48小时的细胞的Rskl、PCNA、 p70S6K、mT0R和PTEN的蛋白质印迹分析。
[0127] 图14d显示aiRNA对k-Ras的等位基因特异性基因沉默。通过蛋白质印迹分析， 测试靶向野生型k-Ras的aiRNA在k-Ras野生型（DLDl)和k-Ras突变型（SW480)细胞系 中对k-Ras的沉默。
[0128] 图15显示aiRNAs的通过有义链的脱靶基因沉默的缺乏、以及aiRNA的免疫刺激 作用和血清稳定性。
[0129] 图15a显示在模拟（mock)处理的或与β -联蛋白SiRNA或aiRNA双链体温育16 小时的PBMC中干扰素诱导型基因的表达的RT-PCR分析。
[0130] 图15b显示在模拟转染的或用EF2或存活蛋白aiRNA或SiRNA转染24小时的Hela 细胞中干扰素诱导型基因的表达的RT-PCR分析。
[0131] 图15c显示对已知干扰素应答相关基因的表达改变的微阵列分析。通过微阵列分 析从aiRNA和siRNA转染的Hela细胞中分离的总RNA。
[0132] 图15d显示对于aiRNA未检测出有义链介导的脱靶基因沉默。用aiRNA或siRNA 和表达Stat3 (有义RNA)的质粒或表达反义Stat3 (反义RNA)的质粒共转染细胞。在转 染后24小时收获细胞并且收集RNA，通过定量实时PCR或RT-PCR测定Stat3有义或反义 RNA (插入片段）的相对水平。
[0133] 图15e显示aiRNA和siRNA双链体在人血清中的稳定性。aiRNA和siRNA双链体 在10%人血清中在37°C温育所示时间，之后凝胶电泳。显示剩余的双链体（对照％ )。
[0134] 图15f说明对aiRNA双链体介导的基因特异性沉默所提出的模型。
[0135] 图16显示在SW480人结肠异种移植小鼠模型中，针对β -联蛋白的aiRNA的有 力抗肿瘤活性。具有建立的皮下SW480人结肠癌的免疫抑制小鼠每天静脉内（iv)给予 0. 6nmol PEI-复合的β -联蛋白siRNAs、PEI-复合的β -联蛋白aiRNAs、或作为阴性对照 的PEI-复合的无关siRNA。在处理过程中定期评估肿瘤大小。每个点表示6个肿瘤的平均 值土 SEM。
[0136] 图17显示在HT29人结肠异种移植小鼠模型中，针对β -联蛋白的aiRNA的有力 抗肿瘤活性。具有建立的皮下HT29人结肠癌的免疫抑制小鼠每隔一天静脉内（iv)给予 0. 6nmol PEI-复合的β -联蛋白siRNAs、PEI-复合的β -联蛋白aiRNAs、或作为阴性对照 的PEI-复合的无关SiRNA。在处理过程中定期评估肿瘤大小。每个点表示5个肿瘤的平均 值土 SEM。
【具体实施方式】
[0137] 本发明涉及能够在真核细胞中实现选择性基因沉默的不对称双链体RNA分子。在 一个实施方案中，双链体RNA分子包括第一链和第二链。第一链长于第二链。第二链与第 一链基本上互补，并且与第一链形成双链区。
[0138] 在一个实施方案中，双链体RNA分子具有1-8个核苷酸的3' -突出端和1-8个核 苷酸的5' -突出端，1-10个核苷酸的3' -突出端和平头末端，或1-10个核苷酸的5' -突出 端和平头末端。在另一个实施方案中，双链体RNA分子具有两个1-8个核苷酸的5' -突出 端或两个1-10个核苷酸的3' -突出端。在一个进一步的实施方案中，第一链具有1-8个核 苷酸的3' -突出端和1-8个核苷酸的5' -突出端。在一个更进一步的实施方案中，双链体 RNA分子是分离的双链体RNA分子。
[0139] 在一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3' -突出端、和1-10个核苷酸的 5' -突出端或5' -平头末端。在另一个实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的3' -突出 端和1-10个核苷酸的5' -突出端。在一个备选实施方案中，第一链具有1-10个核苷酸的 3'-突出端和5'-平头末端。
[0140] 在一个实施方案中，第一链具有5-100个核苷酸、12-30个核苷酸、15-28个核苷 酸、18-27个核苷酸、19-23个核苷酸、20-22个核苷酸、或21个核苷酸的长度。
[0141] 在另一个实施方案中，第二链具有3-30个核苷酸、12-26个核苷酸、13-20个核苷 酸、14-23个核苷酸、14或15个核苷酸的长度。
[0142] 在一个实施方案中，第一链具有5-100个核苷酸的长度，并且第二链具有3-30个 核苷酸的长度；或第一链具有10-30个核苷酸的长度，并且第二链具有3-29个核苷酸的长 度；或第一链具有12-30个核苷酸的长度，并且第二链具有10-26个核苷酸的长度；或第 一链具有15-28个核苷酸的长度，并且第二链具有12-26个核苷酸的长度；或第一链具有 19-27个核苷酸的长度，并且第二链具有14-23个核苷酸的长度；或第一链具有20-22个核 苷酸的长度，并且第二链具有14-15个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链 具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有13-20个核苷酸、14-19个核苷酸、14-17个核苷 酸、14或15个核苷酸的长度。
[0143] 在一个实施方案中，第一链比第二链长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。
[0144] 在一个实施方案中，双链体RNA分子还包括1-10个未配对的或错配的核苷酸。在 一个进一步的实施方案中，未配对或错配的核苷酸在3'凹缺末端处或附近。在一个备选实 施方案中，未配对或错配核苷酸在5'凹缺末端处或附近。在一个备选实施方案中，未配对 或错配核苷酸在双链区处。在另一个实施方案中，未配对或错配的核苷酸序列具有1-5个 核苷酸的长度。在一个更进一步的实施方案中，未配对或错配的核苷酸形成环结构。
[0145] 在一个实施方案中，第一链或第二链包含至少一个切口或由2个核苷酸片段形 成。
[0146] 在一个实施方案中，基因沉默通过RNA干扰、翻译调节和DNA外遗传调节中的一种 或两种或全部来达到。
[0147] 在说明书和权利要求中，除非上下文另有明确说明，单数形式"a"、"an"和"the" 包括对复数的提及。例如，术语"细胞"包括多个细胞，包括其混合物。
[0148] 如本文所使用的，"双链RNA"、"双链体RNA"或"RNA双链体"指具有2条链并且具 有至少一个双链区的RNA，其包括在双链区内或在2个相邻的双链区之间具有至少一个缺 口、切口、凸起和/或鼓泡的RNA分子。如果一条链在2个双链区之间具有缺口或单链的 未配对核苷酸区，那么该链视为具有多个片段。如本文所使用的，双链RNA可以在任一末端 或2个末端上具有末端突出。在某些实施方案中，双链体RNA的2条链可以通过化学接头 连接。
[0149] 如本文所使用的，"反义链"指与靶信使RNA具有基本上的序列互补性的RNA链。 反义链可以是siRNA分子的一部分、miRNA/miRNA*双链体的一部分、或单链成熟miRNA。
[0150] 如本文所用的，术语"分离的"或"纯化的"是指，物质实质上或基本上不含在其天 然状态下与其正常相伴的成分。纯度和均质性一般利用分析化学技术来确定，例如聚丙烯 酰胺凝胶电泳或高效液相色谱。
[0151] 如本文所使用的，"调节"及其语法等同体是指，增加或减少（例如沉默），换言之， 上调或下调。如本文所使用的，"基因沉默"指基因表达的减少，并且可以指靶基因的基因表 达的约 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 95%减少。
[0152] 如本文所用，术语"受试者"是指，任何将作为特定治疗的接受者的动物（例如，哺 乳动物），包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物等。一般，术语"受试者"和"患者" 就人类受试者而言在本文可互换使用。
[0153] 如本文所用的，诸如"治疗"或"缓解"等术语既指1)治愈、减缓、减轻所诊断病情 或病症的症状，和/或中断其进展的治疗性措施，又指2)防止或减缓所靶向病情或病症的 发展的防范性或预防性措施。因而，需要治疗的包括已经患有病症的那些；易患病症的那 些；以及欲预防病症的那些。如果患者显示出如下一种或多种状况，则该受试者被本发明的 方法成功地"治疗":癌细胞数量的减少或完全无癌细胞；肿瘤大小的减小；抑制或不存在癌 细胞向周围器官的浸润、包括癌向软组织和骨的扩散；抑制或不存在肿瘤转移；抑制或不 存在肿瘤生长；与具体癌症相关的一种或多种症状的减轻；减小的发病率和死亡率；和生 活质量的提尚。
[0154] 如本文所用，当用在生物活性的语境中时，术语"抑制"及其语法等同体是指生物 活性的下调，这可以减小或消除所靶向的功能，例如蛋白质的生产或分子的磷酸化。在 特别的实施方案中，抑制可以指所靶向活性的约20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%或95%的减小。当用于病症或疾病的语境中时，该术语是指成功地防止症状发作、缓解 症状或消除疾病、病情或病症。
[0155] 如本文所使用的，术语"基本上互补"是指，在2个核酸之间的碱基配对双链区而 非任何单链区中的互补，所述单链区例如末端突出端或2个双链区之间的缺口区。互补无 需是完全的；例如，在2个核酸之间可以存在任何数目的碱基对错配。然而，如果错配数 目大到即使是在最低严格杂交条件下也无法发生杂交时，那么该序列不是基本上互补的序 列。当2个序列在本文中称为"基本上互补"时，意味着这两个序列彼此充分互补以能在所 选反应条件下发生杂交。核酸互补性和足以达到特异性的杂交严格性之间的关系是本领域 众所周知的。2条基本上互补的链可以例如是完全互补的，或可以包含1个至多个错配，只 要杂交条件足以允许例如区分配对序列和非配对序列即可。因此，基本上互补的序列可以 指在双链区中具有100、95、90、80、75、70、60、50%或更少或之间的任何百分数的碱基对互 补性的序列。
[0156] 如本文所使用的，antagomirs是miRNA抑制剂，可以用于沉默内源miRNA。如本文 所使用的，mimetics或mimics是miRNA激动剂，可以用于作为功能等价物替换内源miRNA， 并由此上调受此内源miRNA影响的途径。
[0157] L RNA 干扰
[0158] RNA干扰（缩写为RNAi)是由双链RNA (dsRNA)诱导的用于靶向破坏单链 RNA(ssRNA)的细胞过程。该ssRNA可以是基因转录物例如信使RNA(mRNA)。RNAi是一种 转录后基因沉默形式，其中dsRNA可以特异地干扰与dsRNA具有互补序列的基因的表达。 dsRNA的反义RNA链靶向互补基因转录物例如信使RNA(mRNA)，以实现由核糖核酸酶的切 割。
[0159] 在RNAi过程中，长dsRNA通过核糖核酸酶蛋白质Dicer加工成称为小干扰 RNA(siRNA)的短形式。siRNA分离成引导（guide strand或反义）链和过客（passenger 或有义）链。引导链整合到RNA诱导的沉默复合物（RISC)内，其是含核糖核酸酶的多蛋白 复合物。复合物随后特异性靶向互补基因转录物进行破坏。
[0160] RNAi已被证实是许多真核生物中的常见细胞过程。RISC以及Dicer在真核生物 界中是保守的。RNAi被认为在针对病毒和其他外来遗传物质的免疫应答中起作用。
[0161] 小干扰RNA (siRNA)是一类短双链RNA (dsRNA)分子，发挥多种生物学作用。最显著 地，其参与RNA干扰（RNAi)途径，在此途径中siRNA干扰特定基因的表达。此外，siRNA还 在例如抗病毒机制或基因组的染色质结构成形等过程中起作用。在一个实施方案中，siRNA 具有短（19_21nt)双链RNA (dsRNA)区以及2-3个核苷酸的3'突出端和5' -磷酸和3' -羟 基末端。
[0162] 微小RNA(miRNA)是一类内源、单链或双链、长约22个核苷酸的RNA分子，其调节 多达30%的哺乳动物基因（Czech，2006 ;Eulalio等人，2008 ;Mack，2007)。miRNA通过阻断 翻译或引起转录物降解来阻遏蛋白质产生。miRNA可以靶向250-500种不同mRNA。miRNA 是miRNA前体的Dicer消化产物，所述miRNA前体是初级miRNA (pri-miRNA)的产物。
[0163] 如本文所使用的，antagomirs是miRNA抑制剂，可以用于沉默内源miRNA。如本文 所使用的，mimetics是miRNA激动剂，可以用于替换miRNA和下调mRNA。
[0164] Dicer是RNA酶III核糖核酸酶家族成员。Dicer将长双链RNA(dsRNA)、微小 RNA(miRNA)前体、和短发夹RNA(shRNA)切割成约20-25个核苷酸长度的、通常在3'末端 上具有2个碱基突出的短双链RNA片段，称为小干扰RNA (siRNA)。Dicer催化RNA干扰途 径中的第一个步骤，并且起始RNA诱导的沉默复合物（RISC)的形成，该复合物的催化组分 argonaute是能够降解信使RNA (mRNA)的核酸内切酶，其中该信使RNA的序列与siRNA引导 链的序列互补。
[0165] 如本文所使用的，有效siRNA序列是在触发RNAi以降解靶基因的转录物方面有 效的siRNA。并非与靶基因互补的每一个siRNA都可以有效地触发RNAi降解基因的转录 物。事实上，通常需要耗费时间的筛选以鉴定有效的siRNA序列。在一个实施方案中，有 效siRNA序列能够使靶基因表达减少90%以上、80%以上、70%以上、60%以上、50%以上、 40%以上或30%以上。
[0166] 本发明提供称为不对称干扰RNA (aiRNA)的新结构支架，其可以用于实现siRNA样 结果，也可以用于调节miRNA途径活性（在与本申请同一天提交的、名为"Composition of Asymmetric RNA Duplex as MicroRNA Mimetic or Inhibitor"的、共同拥有的PCT和美国 申请中详细描述，其完整内容引入本文作为参考）。
[0167] aiRNA的新结构设计不仅在实现基因调节方面是功能上有效的，还提供超过现有 技术RNAi调节剂（主要是反义，siRNA)的几个优点。在这些优点中，aiRNA可以比现有 siRNA构建体具有长度短得多的RNA双链体结构，这将减少合成成本和消除或减少长度依 赖性的、自宿主细胞的非特异性干扰素样免疫应答的触发。aiRNA中过客链的较短长度还将 消除或减少RISC中过客链的非故意掺入，从而又可以减少在miRNA介导的基因沉默中观察 至Ij的脱靶效应。aiRNA可以用于目前基于miRNA的技术正在应用或考虑应用的所有领域，包 括生物学研究、生物技术和医药工业中的R&D研究、以及基于miRNA的诊断和治疗。
[0168] 2. aiRNA 结构支架
[0169] Elbashir等人测试了几种不对称双链体RNA分子以及对称siRNA分子（Elbashir 等人，2001c)。该不对称双链体RNA分子和相应的siRNA分子在表1中列出。
[0170] 表 1
[0172] 然而，与相应的对称siRNA分子比较，这些不对称双链体RNA分子未能实现选择性 基因沉默（同上引文）。
[0173] 本发明涉及能够实现序列特异性基因沉默的不对称双链体RNA分子。在一个实施 方案中，本发明的RNA分子包括第一链和第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与 第一链形成双链区，其中第一链长于第二链；排除Elbashir (Elbashir等人，2001c)中公开 的不对称双链体RNA分子，特别是表1中列出的不对称双链体RNA分子。RNA分子包括双链 区、以及独立地选自5' -突出端、3' -突出端和平头末端的2个末端。该RNA链可以具有未 配对或不完全配对的核苷酸。
[0174] 在一个实施方案中，第一链比第二链长至少lnt。在一个进一步的实施方案中，第 一链比第二链长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20扯。在另一 个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链 长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长3-10nt。
[0175] 在一个实施方案中，双链区具有3_98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双 链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-19bp的长度。双 链区的长度可以是 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29 或 30bp。<