1^1、1^-1^18、5七&七3、？〇嫩、觸01、肌动蛋白（5&1^3〇1^)4卩2、口70561(、 mT0R、PTEN(Cell Signaling Technology)、Ago2(Wako)、Dicer(Novus)和 Parpl(EMD Biosciences)的一抗。通过增强的化学发光（GE Biosciences)显现抗原-抗体复合物。
[0313] 5' -RACE分析
[0314] 无需任何先前加工，来自用非沉默aiRNA或aiRNA处理的Hela细胞的总 RNA(5yg)与 GeneRacer? RNA 衔接子（Invitrogen，5'-CGACUGGAGCACGAG GACAC UGACAUGGACU GAAGGAG UAGAAA-3'（SEQ ID N0:79))连接。使用随机引物将连接的 RNA 逆 转录成cDNA。为了检测切割产物，使用与RNA衔接子互补的引物（GeneRacer? 5'Nested Primer:5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3'（SEQ ID N0:80))和 β-联蛋白特异性引物 (GSP:5'-CGCATGATAGCGTGTCTGGAAGCTT-3'（SEQ ID Ν0:81))执行 PCR。扩增片段在 1.4% 琼脂糖凝胶上分离，并且使用1-kb Plus DNA Ladder(Invitrogen)确定大小。通过DNA测 序进一步验证特异性切割位点。
[0315] 干扰素应答检测
[0316] 对于图15a中的实验，使PBMC直接与IOOnMβ -联蛋白siRNA或aiRNA -起温 育。在16小时使用TRIZOL纯化总RNA，并且按制造商（System Biosciences)所述的通过 RT-PCR测定响应干扰素的基因表达的水平。对于图15b中的实验，Hela细胞进行模拟转染 或用IOOnM所示aiRNA或siRNA转染24小时。使用TRIZOL纯化总RNA，并且通过RT-PCR测 定响应干扰素的基因表达的水平。对于微阵列分析，Hela细胞用IOOnM aiRNA或siRNA进 行转染。在24小时使用TRIZOL纯化总RNA，并且根据制造商的方案（ExpressionAnalysis， Inc. )，RNA 用于与 Human Genome U133 Plus 2. OGeneChip(Affymetrix)杂交。来自 DharmaFECT 1处理的细胞的RNA用作对照。为了计算转录物表达值，使用Mi croarray Suite 5.0以及分位数标化（quantile normalization)，在本研究中使用具有足够杂交信 号而被称为存在（P)的转录物。
[0317] aiRNA和 siRNA序列
[0318] aiRNA和siRNA双链体的序列和结构在表2中列出。在k-Ras aiRNA中框出了点 突变的位置。
[0319] 表 2
[0320]
[0321] In Life评估
[0322] 还进行每只动物的健康状况的每日检查。每3天检查体重。根据实验室的动物饲 养操作每天供应食物和水。产生>20%致死率和/或>20%净体重减轻的处理被视为毒性 的。结果表示为平均肿瘤体积（mm 3) 土SE。P值〈0.05视为统计上相关的。
[0323] 动物管理：
[0324] 4-5周龄的雄性或雌性无胸腺裸鼠 （Charles River Laboratories, Wilmington, ΜΑ.)在研究开始前适应动物畜舍设施至少一周。所利用的所 有实验方法与美国生理学会（American Physiology Society)所给出的指南以及实验动 物护理和使用指南（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)相符，并且 也得到了波士顿生物医学公司（Boston Biomedical Inc.)研究所动物护理和使用委员 会（Institutional Animal Care and Use Committee)的批准。动物 4 只一组关进木 肩铺底的笼中，置于具有控制的温度（68° F-72° F)、光照（12小时光-暗周期）和湿度 (45 - 55%)的房间。实验期间动物自由饮水摄食。
[0325] 实施例1.不对称干扰RNA (aiRNA)在晡乳动物细朐中引起基闵特异件沉默
[0326] SiRNA结构支架被认为是掺入RISC和介导RNAi的必需构型（Elbashir等人， 2001a ;Elbashir 等人，2001b ;Elbashir 等人，2001c ;Rana，2007 ;Zamore 等人，2000)。然 而，关于RISC掺入和基因沉默对RNA双链体支架的要求却知之甚少。为了研究有效的 RNAi介体和RISC底物所需的结构支架，我们首先测定比siRNA短的RNA双链体是否能够 介导基因沉默。双链（ds)RNA的长度是决定其激活蛋白质激酶R(PKR)-介导的非特异性 干扰素应答的倾向、增加的合成成本和递送问题的一个重要因素（Elbashir等人，2001b ; Sledz等人，2003)。我们设计了靶向不同哺乳动物基因的一系列12至21bp短dsRNA，该短 dsRNA具有2核苷酸3'突出端或平头末端。在长度减少到低于19bp后检测不到基因沉默 (数据未显示），这与在黑腹果绳（Drosophila Melanogaster)细胞裂解物中的先前报告 一致（Elbashir等人，2001b)，并与19-21bp是介导RNAi的最短siRNA双链体的观念一致 (Elbashir 等人，2001a ;Elbashir 等人，2001b ;Elbashir 等人，2001c ;Rana，2007 ;Zamore 等人，2000)。
[0327] 接下来我们测试了具有不对称构型的突出端的非siRNA支架RNA双链体是否能够 介导基因沉默。siRNA双链体包含对称的有义链和反义链。虽然包含3'突出端的双链体 siRNA结构是掺入RISC复合物内所需的，但在Argonaute(Ago)介导的有义链切割后，由反 义链指导革EmRNA 的切割（Hammond 等人，2001 ;Matranga 等人，2005 ;Tabara 等人，1999)。 我们寻求制备在反义链的3'和5'末端具有突出端的各种长度的不对称RNA双链体。
[0328] 在退火后通过20 %聚丙烯酰胺凝胶验证具有表3中所示序列的寡聚物。如 图3A中所示，每个泳道按如下加样：泳道l，21nt/21nt ;泳道2，12nt(a)/21nt ;泳道 3,12nt (b)/21nt ;泳道 4,13nt/13nt ;泳道 5,13nt/21nt ;泳道 6,14nt/14nt ;泳道 7， 14nt (a) /21nt ;泳道 8,14nt (b) /21nt ;泳道 9,15nt/15nt ;泳道 10,15nt/21nt。
[0329] 表 3
[0330]
[0331] HeLa细胞以200, 000细胞/孔接种到6孔培养板内。如图3B中所示，24小时 后，它们用scrambled siRNA(泳道1)、靶向E2F1的21-bp siRNA(泳道2,作为特异性的 对照）或靶向β-联蛋白的21-bp SiRNA(泳道3,作为阳性对照）、或相同浓度的不同长 度混合的 aiRNA:12nt(a)/21nt (泳道 4) ;12nt(b)/21nt (泳道 5) ;13nt/21nt (泳道 6); 14nt(a)/21nt (泳道 7) ;14nt(b)/21nt (泳道 8) ;15nt/21nt (泳道 9)，进行转染。在转染 后48小时收获细胞。通过蛋白质印迹测定β-联蛋白的表达。E2F1和肌动蛋白用作对照。 结果证实不对称干扰RNA (aiRNA)在哺乳动物细胞中引起基因特异性沉默。
[0332] 为了确定在aiRNA功能中重要的aiRNA结构特征，基于对核心15/21双重反义突 出端结构的修饰，我们产生了多种aiRNA寡核苷酸（表4)。在表4中概括的aiRNA包含修 饰，包括但不限于，有义和反义链的长度、有义和反义突出端的程度、和RNA-DNA杂合寡核 苷酸。
[0333] 通过改变有义链、反义链或两者，对亲本15/21aiRNA结构进行了修饰（表4)。以 50nM用经修饰的aiRNA双链体转染Hela细胞48小时。使用β -联蛋白和肌动蛋白的蛋白 质印迹，检查与亲本15/21 aiRNA和常规siRNA结构相比的基因沉默程度。还测试了包含 双重有义链突出端的aiRNA修饰。这些寡核苷酸包含与不同长度反义链配对的21碱基有 义链。此外，还检查了已用DNA碱基进行修饰的aiRNA寡核苷酸的活性。对反义和有义链 均进行了 DNA置换（表3)。所测试的RNA-DNA杂合寡核苷酸包含在有义或反义链中的1个 或多个DNA置换，或包含与所示长度的DNA有义链配对的21碱基反义RNA。这各种aiRNA 的基因沉默结果显示于图4和5中。
[0334] 这些数据总的提供了关于aiRNA功能的结构线索。
[0335] 就有义链而言，我们的数据指出15个碱基的长度工作良好，而14至19个碱基的 长度保持功能。有义链可以匹配反义链的任何部分，条件是满足反义突出端规则。在有义 链的5'或3'末端处单RNA碱基的DNA替换是耐受的，并且甚至可能提供增加的活性。
[0336] 就反义链长度而言，21个碱基的长度工作良好，19-22个碱基保持活性，当长度降 到低于19个碱基或增至超过22个碱基时，活性降低。反义链的3'末端要求1-5个碱基的 突出端，其中2-3碱基突出端是优选的，平头末端显示活性的减少。与靶RNA序列的碱基配 对是优选的，并且不超过3个碱基的DNA碱基替换在无同时的5' DNA碱基替换时是耐受的。 反义链的5'末端优选0-4碱基突出端，并且不需要突出端以保持活性。反义链的5'末端 可以耐受2个碱基不匹配靶RNA序列，并且在无同时的3' DNA碱基替换时可以耐受高达3 个碱基的DNA碱基置换。
[0337] 就错配或化学修饰的碱基而言，我们发现，对有义或反义链中的错配和一个或多 个化学修饰碱基，aiRNA结构均可以耐受。
[0338] 表4 :用于图4-5的aiRNA序列
[0343] 在表4中，A、U、G和C表;^核苷酸，而a、t、g和c表;^脱氧核苷酸D
[0344] 实施例2.由aiRNA触发的基因沉默的机制
[0345] 为了研究由aiRNA诱导的基因敲低的机制，我们首先确定由aiRNA导致的基因沉 默在翻译水平还是mRNA水平上发生。在用IOnM 15bp aiRNA转染的细胞中进行β-联蛋 白的RNA印迹分析，显示aiRNA在24小时内使mRNA水平减少超过95%，并且该减少持续4 天以上（图6a)，提示aiRNA在mRNA水平上介导基因沉默。与siRNA相比，由aiRNA诱导 的β -联蛋白mRNA减少实质性地更快速、更有效和持久（图6a)。我们进一步确定15bp aiRNA是否催化β-联蛋白mRNA的位点特异性切割。通过cDNA末端的快速扩增（5'-RACE) 和PCR，就β -联蛋白mRNA切割片段的存在，检查从用15bp aiRNA转染的细胞中分离的总 RNA (图6b)。在aiRNA转染后4和8小时检测到β -联蛋白切割片段（图6c)。序列分析 显示切割在aiRNA靶序列内在相对于aiRNA反义链5'末端的碱基10和11之间发生（图 6d)。在用scrambled aiRNA转染后未观察到此种切割片段（图6c)。这些结果证实aiRNA 通过序列特异性切割靶mRNA而诱导强有力的有效基因沉默。
[0346] 接下来我们确定该新的aiRNA不对称支架是否能够掺入RISC内。RNAi通过RISC 酶复合物催化，其中Argonaute蛋白质（Ago)作为复合物的催化单位（Liu等人，2004 ; Matranga等人，2005)。为了确定aiRNA是否掺入Ago/RISC复合物内，在用aiRNA转染细胞 后，自表达myc标签-Agol的细胞免疫沉淀myc标签-人Agol (Siolas等人，2005)。通过 对Ago免疫沉淀物的RNA印迹，检测与RISC复合物结合的小RNA。RNA印迹分析揭示aiRNA 以高效率进入RISC复合物内（图6e)。这些数据说明aiRNA的不对称支架可以有效掺入 RISC 内。
[0347] 因为aiRNA诱导比siRNA更有效的基因沉默，所以我们测试aiRNA是否能够比 siRNA更有效地产生RISC复合物。如图6e中所示，aiRNA-Ago2/RISC复合物比siRNA-Ago2/ RISC复合物更快速且更有效地形成，其中在RISC复合物中包含的aiRNA比相应siRNA多 (图6e和图7A)。值得注意的是，siRNA表现出典型模式（21)，这与siRNA形成二级结构 相一致（图6e和图7)。相反地，aiRNA表现出单条带，说明长度较短的aiRNA可以减少或 消除伴随siRNA发生的二级结构形成。
[0348] 此外，aiRNA的不对称构型可以促进具有反义链的活性RISC的形成，减少由有义 链形成的无效RISC(参考文献16)。我们的数据证明确实如此（如图7B中所示），在RISC 复合物中不能检测出有义链。图8A还证实尽管aiRNA的反义链与Ago 2强烈结合，但有义 链却不发生结合。相反地，siRNA的反义和有义链都与Ago 2结合。这些数据提示，aiRNA 在细胞中具有比siRNA更高的RISC形成效率，这可解释aiRNA的优良基因沉默效率。
[0349] 此外，已证实，为了具有功能，siRNA的有义链需要被切割。因此，我们测试了对于 aiRNA是否存在相同需求。为此，用2'-0-甲基修饰在aiRNA有义链的位置8或9处的核苷 酸，以使得其无法切割。结果显示，具有无法切割的有义链的aiRNA仍是有功能的（图8B)， 说明aiRNA就其机制而言与siRNA非常不同。
[0350] 进一步，我们调查了对于aiRNA和siRNA是否存在任何不同的装载口袋。使用冷 aiRNA或siRNA与放射性标记的siRNA或aiRNA竞争RISC复合物（图9)。令人惊讶的是， 结果显示，冷aiRNA不与siRNA竞争RISC复合物（图9B)，并且冷siRNA也不与aiRNA竞争 RISC复合物（图9C)。这些数据指出aiRNA和siRNA可能装载至RISC复合物的不同口袋。
[0351] 上面的数据总的说明，aiRNA是可以掺入RISC内的第一种非siRNA支架，由此提 供了与RISC相互作用的新结构支架。aiRNA和siRNA的RISC装载差异在图10显示的模型 中说明。简言之，因为不对称性质，仅反义链被选择保留在RISC复合物中，由此导致100% 的链选择效率。相反地，siRNA在结构上是对称的。siRNA的反义链和有义链都有机会被选 择保留在RISC复合物中，因此siRNA具有低效的链选择，并且同时由于有义链RISC复合物 而可引起非特异性基因沉默。
[0352] 实施例3. aiRNA介导比siRNA审怏谏、有力、有效目持久的基闵沉默
[0353] 为了比较aiRNA与siRNA的基因沉默性质，我们首先确定用于基因沉默的最佳 aiRNA结构。
[0354] siRNA双链体包含对称的有义链和反义链。虽然包含3'突出端的双链体siRNA结 构是掺入RISC复合物内所需的，但在Argonaute (Ago)介导的有义链切割后，靶mRNA的切 割由反义链指导（Hammond等人，2001 ;Matranga等人，2005 ;Tabara等人，1999)。我们寻求 制备在反义链的3'和5'末端处具有突出端的各种长度的不对称RNA双链体。设计了具有 3'和5'反义突出端的12至15bp的一组不对称RNA双链体，以靶向β -联蛋白（图11A)， β-联蛋白是牵涉癌症和干细胞的一种内源基因（Clevers，2006)。具有标准构型的最佳化 siRNA已被设计出来靶向β-联蛋白用于触发RNAi (Xiang等人，2006)。在由siRNA靶向的 相同序列内设计针对β-联蛋白的所有aiRNA(图11A)。结果显示，用15bp aiRNA达到了 最佳基因沉默（图11B)。因此，我们在后续实验中使用15bp aiRNA与21-mer siRNA双链 体进行比较。
[0355] 令人惊讶的是，发现aiRNA诱导对β -联蛋白蛋白质的有力和高效减少，同时不伤 害非靶对照基因肌动蛋白（图11C)。
[0356] 接下来，我们检查了由靶向β -联蛋白的aiRNA和siRNA介导的基因沉默的开始。 所使用的aiRNA和siRNA的序列显示于图IlA中。如图12中所示，aiRNA具有更快的开始 (图12C和D)以及更佳的功效（图12B和D)。
[0357] 还比较了 aiRNA和siRNA对各种靶和多种人细胞系的基因沉默作用。在已经被 siRNA以低效率靶向的相同序列（Rogoff等人、2004)处，设计aiRNA以靶向不同功能类型 的基因，包括 Stat3(图 13b)、NQ01(图 12d)、延伸因子 2(EF2)(图 13c)、Nbsl (图 14b)、存 活蛋白（图 14b)、Parpl (图 14b)、p21(图 14b)、Rskl (图 14c)、PCNA(图 14c)、p70S6K(图 14c)、mTOR(图14c)和PTEN(图14c)以及β -联蛋白（图13a)。如图13和14中所示， aiRNA 在沉默 Stat3、β -联蛋白、Rskl、p70S6K、Nbsl、mTOR 和 EF2 方面比 siRNA 更有效， 在沉默NQ01、PCNA、存活蛋白、PTEN、Parpl和p21方面与siRNA -样有效。因为靶序列是 基于针对siRNA的优化来选择的，所以可能地aiRNA的功效和效力可以通过针对aiRNA优 化的靶位点而得到进一步增加。此外，我们的数据还显示aiRNA可以在多种细胞系，包括 Hela(图13a)、H1299(图14a，左图）和Dldl(图14a，右图），中比siRNA更有效地抗β-联 蛋白。
[0358] 总之，这些数据证实aiRNA在哺乳动物细胞中可以比siRNA更有效、有力、快速开 始和持久地介导基因沉默。
[0359] 实施例4.由aiRNA介导的基闵沉默的特异件
[0360] 接下来，我们研究了由aiRNA介导的基因沉默的特异性。首先分析靶向野生型 k-Ras等位基因的aiRNA。DLDl细胞包含野生型k-Ras，而SW480细胞包含具有单碱基对置 换的突变型k-Ras (图14d)。用靶向野生型k-Ras的aiRNA转染DLDl细胞显示出有效沉 默，但在SW480细胞中未观察到突变型k-Ras的沉默。这些数据证实aiRNA介导等位基因 特异性基因沉默。
[0361] 干扰素样应答的激活是基因沉默的主要非特异性机制。SiRNA用于基因沉默的 一个主要原因是短于30bp的dsRNA在哺乳动物细胞中具有降低的激活干扰素样应答的 能力（Bernstein 等人，2001 ;Martinez 和 Tuschl，2004 ;Sledz 等人，2003)。我们检查了 aiRNA是否在哺乳动物细胞中显示出激活干扰素样应答的任何迹象。从转染了抗β-联蛋 白的aiRNA的PBMC细胞和转染了抗EF2或存活蛋白的aiRNA的Hela细胞中收集RNA，通 过RT-PCR分析干扰素诱导型基因。通过RT-PCR发现aiRNA转染显示出不增加所测试的任 何干扰素诱导型基因，而靶mRNA的水平相对于对照转染细胞减少（图15a和b)。还执行 微阵列分析，以比较由aiRNA和siRNA诱导的已知干扰素应答相关基因的表达改变。如图 15c中所示，与siRNA比较，对于aiRNA观察到少得多的改变。
[0362] 此外，如上所述，有义链-RISC复合物可以引起非特异性基因沉默。为了比较 aiRNA和siRNA通过有义链-RISC复合物介导的非特异性基因沉默，用aiRNA或siRNA和表 达Stat3 (有义RNA)的质粒或表达反义Stat3 (反义RNA)的质粒共转染细胞。在转染后24 小时收获细胞并且收集RNA，通过定量实时PCR或RT-PCR测定Stat3有义或反义RNA (插 入片段）的相对水平。结果显示，aiRNA对反义Stat3 mRNA没有作用，而siRNA则有作用 (图15d)。这个结果说明aiRNA完全消除了由有义链-RISC复合物介导的非期望的非特异 性基因沉默。
[0363] 总之，已证实，aiRNA是新一类的基因沉默诱导物、非siRNA型的最小的RISC底 物结构支架、和RNAi介体（图15f)。我们的数据提示，aiRNA通过RISC -一细胞RNAi机 器--工作。在掺入RISC后，aiRNA介导在相对于aiRNA反义链5'末端的碱基10和11之 间对mRNA的序列特异性切割。aiRNA的不对称构型可以比siRNA更有效地与RISC相互作 用。与高RISC结合效率一致，aiRNA在介导针对本研究中测试的基因的基因特异性沉默方 面比siRNA更有力、有效、快速开始和持久。尽管先前研究已提出Dicer在促进有效RISC 形成中的作用，但我们的数据说明，aiRNA可以不依赖于Dicer介导的加工而以高效率导致 活性RISC复合物。
[0364] 这种新RNA双链体支架的关键特征是在3'和5'末端的反义突出端。12_15bp aiRNA是已知诱导RNAi的最短RNA双链体。尽管长dsRNA在秀丽线虫（C.elegans)和黑腹 果蝇中触发有力的基因沉默，但在哺乳动物细胞中基因特异性沉默在使用siRNA双链体前 是不可能的。由Dicer消化限定的siRNA支架的特征在于19-21bp链长度和3'突出端上 的对称性（Bernstein等人，2001)，这已被视为是掺入RISC以介导RNAi所必需的结构。因 此，对RNAi诱导物的优化努力一直集中于siRNA前体，其总是大于siRNA (Soutschek等人， 2004 ;Zhang和Farwell，2007)。我们的数据提示，siRNA不是掺入RISC以介导RNAi的必 需支架。不同长度的aiRNA显示出了一系列的基因沉默功效和RISC掺入效率，从而提供了 理解RISC掺入和激活机制的独特机会。需要研究以进一步理解aiRNA在RISC掺入和RNAi 诱导中的结构-活性关系，这将有助于建立通过靶序列选择、长度、结构、化学组成和修饰 来优化aiRNA用于各种RNAi应用的理论基础。
[0365] 实施例5. aiRNA在体内比siRNA审有效
[0366] 为了研究aiRNA在体内是否有效并且与siRNA比较，测试了 aiRNA和siRNA在人 结肠癌异种移植物模型中的作用。
[0367] 人结肠癌是美国第二大癌症死亡原因。WntP-联蛋白信号途径受到紧密调节，并 且在发育、组织稳态和再生中具有重要功能。Wnt/β-联蛋白信号的失调在各种人癌症中频 繁出现。单独80%的结直肠癌就揭示出通过肿瘤抑制基因腺瘤性结肠息肉的失活或原癌基 因 β-联蛋白的突变而激活该途径。
[0368] 已发现Wnt/ β -联蛋白信号的激活对于不同组织癌症的起始和发展都是重要的。 因此，Wnt/β -联蛋白信号的靶向抑制是用于治疗各种起源的癌症的合理和有希望的新方 法。
[0369] 在体外，通过核酶靶向，已证实β -联蛋白表达在人结肠癌SW480细胞中的减少和 相关的细胞死亡诱导的减少，说明β-联蛋白表达对于体外的肿瘤生长是限速的。
[0370] 将SW480人结肠癌细胞皮下接种到雌性无胸腺裸鼠（SxlO6细胞/小鼠）内，并且 允许形成可触摸肿瘤。在这个研究中，当肿瘤达到约120_ 3时开始给药。动物每天静脉内 (iv)给予0. 6nmol PEI-复合的β -联蛋白siRNA、PEI-复合的β -联蛋白aiRNA、或作为 阴性对照的PEI-复合的无关siRNA。动物接受总共10剂siRNA、aiRNA或对照。在处理过 程中测量肿瘤。如图16中所示，用siRNA和aiRNA作为单一疗法以0. 6nmol mg/kg进行的 静脉内处理显著地抑制了肿瘤生长。siRNA的％ T/C值经计算为48. 8%，p值为0. 0286。 而用β-联蛋白-特异性aiRNA进行的处理导致了肿瘤生长有力得多的减少。％ T/C值 经计算为9. 9%，p值为0. 0024。无由于siRNA、aiRNA或对照的iv施用导致的体重显著改 变。这些数据说明，通过PEI复合全身性体内应用aiRNA以靶向β-联蛋白，提供了一种开 发高效、特异且