安全的药剂用于治疗应用于结肠癌患者的途径。
[0371] 此外，我们还在ΗΤ29人结肠癌异种移植物模型中测试了 aiRNA和siRNA的作用。 将HT29人结肠癌细胞皮下接种到雌性无胸腺裸鼠（6xl06细胞/小鼠）内，并且允许形成 可触摸肿瘤。在这个研究中，当肿瘤达到约200mm 3时开始给药。动物每隔一天用0.6nmol PEI-复合的β -联蛋白siRNA、PEI-复合的β -联蛋白aiRNA、或作为阴性对照的PEI-复 合的无关siRNA进行静脉内（iv)处理。动物接受总共8剂siRNA、aiRNA或对照。在处理 中测量肿瘤。如图17中所示，用siRNA和aiRNA作为单一疗法以0.6nmol mg/kg进行的静 脉内处理显著地抑制了肿瘤生长。值经计算为78%，p值为0.21。再次，用 联蛋白-特异性aiRNA的处理导致了肿瘤生长甚至更为有力的减少。％ T/C值经计算 为41%，p值为0. 016。不存在由于siRNA、aiRNA或对照的iv施用导致的体重显著改变。 这些数据再次说明，通过PEI复合全身性体内应用aiRNA靶向β -联蛋白，提供了一种开发 高效、特异且安全的药剂用于治疗应用于结肠癌患者的途径。
[0372] 总之，aiRNA可以显著改善广泛的RNAi应用。基于siRNA的治疗已遇到挑战，包 括有限的功效、递送困难、干扰素样应答和制造成本（de Fougerolles等人，2007 ;Iorns等 人，2007 ;Rana，2007)。aiRNA的改善的功效、效力、持久性和更小的尺寸可以帮助或克服这 些挑战，这是因为aiRNA更小并可能需要更少的材料用于其递送。因此，aiRNA代表了新的 进入RISC的最小RNA双链体，其在哺乳动物细胞中比siRNA更有效、有力、更快开始作用和 更持久地介导基因沉默，其对于基因功能研究和基于RNAi治疗中的广泛RNAi应用，具有显 著的潜力。
[0373] 其他实施方案在下述权利要求内。尽管已显示且描述了几个实施方案，但无需背 离本发明的精神和范围即可进行各种修饰。
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【主权项】
1. 一种不对称干扰RNA双链体分子，其包括 -由19-23个核苷酸组成的反义链，其中该反义链包含3'突出端和5'突出端，其中3' 突出端与靶RNA碱基配对，且其中5'突出端的至少一个核苷酸与靶RNA碱基不互补， -由12-17个核苷酸组成的有义链， 其中所述有义链与所述反义链基本上互补，其中所述反义链与靶mRNA序列至少70% 互补，并且所述有义链与所述反义链形成12、13、14、15、16、或17个碱基对的双链区，其中 所述RNA双链体分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默；所述RNA双链体分子包含至 少一个脱氧核苷酸、或包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。2. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述有义链为12或13个核 苷酸。3. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述5'突出端的至少一个核 苷酸选自A、U或dT。4. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述双链区包括至少一个切 口或缺口。5. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其与选自肽、抗体、聚合物、脂质、 寡核苷酸、胆固醇和适体的实体缀合。6. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至 少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是糖、 主链和/或碱基经修饰的核糖核苷酸。7. 如权利要求6所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述主链经修饰的核糖核苷 酸在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有修饰。8. 如权利要求7所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述磷酸二酯键经修饰而包 括氮或硫杂原子中的至少一种。9. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至 少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述至少一个经修饰的核苷酸或其类似物是稀有 碱基或经修饰的碱基。10. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含 至少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸， 其中2'-011基团由选自11、01?、1?、卤素、311、31?、順 2、順1?、冊2或0~的基团替代，其中每个1? 独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。11. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述RNA双链体分子包含至 少一个经修饰的核苷酸或其类似物，其中所述核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链 经修饰的核糖核苷酸。12. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述真核细胞是哺乳动物细 胞或禽类细胞。13. 如权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子，其中所述反义链包括与选自下 述的基因的靶mRNA序列基本上互补的序列：发育基因，癌基因，肿瘤抑制基因和酶基因，以 及粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成员、Winged螺旋家族成 员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子或其受体、生长/分化因子或其受体、神经递质或其 受体、激酶、信号转导蛋白的基因，病毒基因，感染性疾病的基因、ABLI、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2，ETS1、ETS1、ETV6、FGR、F0S、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、 LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC, MYCL1、MYCN、NRAS、P頂1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3和YES、 APC、BRCA1、BRCA2、MADH4、MCC, NF1、NF2, RBI、TP53、WT1、ACP去饱和酶或羟化酶、ADP-葡萄 糖焦磷酸化酶、ATP酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、 脱羧酶、糊精酶、DNA或RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、 半纤维素酶、整合酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、果胶酯酶、 过氧化物酶、磷酸酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶或肽酶、普鲁兰酶、重 组酶、逆转录酶、拓扑异构酶、木聚糖酶、k-RAS、0 -联蛋白、Rskl、PCNA、p70S6K、存活蛋白、 mTOR、PTEN、Parpl或p21的基因。14. 一种表达载体，其包括与至少一个表达控制序列可操作地连接的编码权利要求1 所述的不对称干扰RNA双链体RNA分子的一个或多个核酸。15.如权利要求14所述的表达载体，其包括与第一表达控制序列可操作地连接的编码 所述第一链的第一核酸、和与第二表达控制序列可操作地连接的编码所述第二链的第二核 酸。16.如权利要求14所述的表达载体，其是病毒、真核或细菌表达载体。17.权利要求14-16任一所述的表达载体在制备调节细胞或生物中的基因表达药物中 的用途。18. -种细胞，其包括权利要求14所述的载体。19. 一种细胞，其包括权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体RNA分子。20.权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物、禽类或细菌细胞。21.权利要求18-20任一所述的细胞在制备调节细胞或生物中的基因表达药物中的用 途。22.权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子在制备调节细胞或生物中的基因表 达药物中的用途，其特征在于，所述药物在施用时，包括步骤：在可以发生选择性基因沉默 的条件下，使所述细胞或生物与权利要求1的不对称干扰RNA双链体分子接触，和 介导由该RNA双链体分子实现的、针对与该RNA双链体具有基本上对应的序列部分的 靶基因或核酸的、选择性基因沉默。23.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述接触步骤包括将所述RNA双链体分子 引入可以发生选择性基因沉默的在培养中的或在生物体中的靶细胞内的步骤。24.如权利要求23所述的用途，其特征在于，其中所述引入步骤选自转染、脂转染、电 穿孔、感染、注射、经□施用、吸入、局部和区域施用。25.如权利要求23所述的用途，其特征在于，其中所述引入步骤包括使用药学上可接 受的赋形剂、载体或稀释剂，其选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合物、纳 米颗粒、纳米乳液、脂质和类脂。26.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述靶基因是与人或动物疾病相关的基 因。27.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述靶基因是致病微生物的基因。28.如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述靶基因是病毒基因。29. 如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述靶基因是肿瘤相关基因。30. 如权利要求22所述的用途，其特征在于，所述靶基因是与选自下述的疾病相关的 基因：自身免疫疾病、炎性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代谢疾病、免疫介 导的病症、变应性疾病、皮肤病学疾病、恶性疾病、胃肠道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病 症、类风湿性病症、神经学病症、内分泌紊乱和衰老。31. -种药物组合物，其包括至少一种权利要求1所述的不对称干扰RNA双链体分子作 为活性剂和一种或多种载体，所述载体选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚 合物、纳米颗粒、胆固醇、脂质和类脂。32. 如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物经由选自iv、po、 sc、im、吸入、局部和区域施用的途径进行施用。33. -种双链体RNA分子，其选自其中A、U、G和C是核苷酸，而a、t、g和c是脱氧核苷酸。
【专利摘要】本发明提供能够实现序列特异性基因沉默的不对称双链体RNA分子。该RNA分子包括第一链和第二链。第一链长于第二链。该RNA分子包括由第一链和第二链形成的双链区、以及独立地选自5ˊ-突出端、3ˊ-突出端和平头末端的两个末端。本发明的RNA分子可以用作研究工具和/或治疗剂。
【IPC分类】A61K48/00, C12N15/63, A61P31/00, C12N15/113, A61P35/00, A61P37/00, C12N5/10
【公开号】CN105018492
【申请号】CN201510250692
【发明人】李嘉强
【申请人】北京强新生物科技有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2008年8月27日
【公告号】CA2735166A1, CA2735167A1, CN101835789A, CN101835789B, CN101842381A, EP2193140A2, EP2193140A4, EP2201022A1, EP2201022A4, US20090208564, US20100286378, WO2009029688A2, WO2009029688A3, WO2009029690A1