（IBD)、关节炎、类风湿性疾病、自身免疫病 症）、皮肤病学疾病。
[0260] 可以使用本发明的不对称双链体RNA分子沉默各种基因。在一个实施方案中， 第一链包括与选自下述的基因的靶mRNA序列基本上互补的序列：发育基因，癌基因，肿瘤 抑制基因和酶基因，以及粘附分子、细胞周期蛋白激酶抑制剂、Wnt家族成员、Pax家族成 员、Winged螺旋家族成员、Hox家族成员、细胞因子/淋巴因子或其受体、生长/分化因 子或其受体、神经递质或其受体、ABLI、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、 EBRB2, ETSl、ETSl、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、 MYC, MYCL1、MYCN、NRAS、P頂1、PML、RET、SRC、TALI、TCL3 和 YES)(例如 APC、BRCA1、BRCA2、 MADH4、MCC, NFl、NF2, RBl、TP53、WTl、ACP去饱和酶或羟化酶、ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、ATP 酶、醇脱氢酶、淀粉酶、淀粉葡糖苷酶、过氧化氢酶、纤维素酶、环加氧酶、脱羧酶、糊精酶、 DNA或RNA聚合酶、半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡萄糖氧化酶、GTP酶、解旋酶、半纤维素酶、整合 酶、转化酶、异构酶、激酶、乳糖酶、脂肪酶、脂加氧酶、溶菌酶、果胶酯酶、过氧化物酶、磷酸 酶、磷脂酶、磷酸化酶、聚半乳糖醛酸酶、蛋白水解酶或肽酶、普鲁兰酶、重组酶、逆转录酶、 拓扑异构酶、木聚糖酶、k-RAS、β-联蛋白、Rskl、PCNA、p70S6K、存活蛋白、mT0R、PTEN、Parpl 或p21的基因。
[0261] 本发明提供治疗疾病或非期望状况的方法。该方法包括使用不对称双链体RNA分 子，以实现与疾病或非期望状况相关的基因的基因沉默。
[0262] 4. 3.将RNA分子（aiRNA)转化成药物
[0263] 4. 3. I. RNA分子的修饰
[0264] 裸RNA分子是相对不稳定的，可以在体内被相对快速地降解。化学修饰可以引入 本发明的RNA分子中，以改善其半衰期和进一步减少非特异性基因打靶效应的危险而不降 低其生物活性。
[0265] 为改善各种RNA分子，包括反义RNA、核酶、适体和RNAi，的稳定性，已研究 了对 RNA 分子的修饰（Chiu 和 Rana，2003 ;Czauderna 等人，2003 ;de Fougerolles 等人，2007 ;Kim 和 Rossi，2007 ;Mack，2007 ;Zhang 等人，2006 ;和 Schmidt，Nature Biotech.25:273-275(2007))。
[0266] 本领域技术人员已知的任何稳定化修饰均可以用于改善本发明RNA分子的稳定 性。在本发明RNA分子内，可以将化学修饰引入磷酸主链（例如，硫代磷酸酯键）、核糖（例 如，锁核酸、2' -脱氧-2' -氟尿苷、2' -0-甲基）、和/或碱基（例如，2' -氟嘧啶）。此种化 学修饰的几个例子在下文中概述。
[0267] 可以采用在核糖的2'位处的化学修饰，例如2' -0-甲基嘌呤和2'-氟嘧啶（其 可以增加抵抗血清中的核酸内切酶活性的抗性），稳定本发明的RNA分子。应小心选择引入 该修饰的位置，以避免显著降低RNA分子的沉默效力。例如，在引导链的5'末端上的该修 饰可以减少沉默活性。另一方面，2'-0_甲基修饰可以在双链区在2条RNA链之间交错，以 改善稳定性同时保存基因沉默效力。2' -0-甲基修饰还可以消除或减少干扰素诱导。
[0268] 另一种稳定化修饰是硫代磷酸酯（P = S)连接。硫代磷酸酯（P = S)键引入RNA 分子内，例如在3' -突出端处，可以提供对抗核酸外切酶的保护作用。
[0269] 脱氧核糖核苷酸引入RNA分子内也可以减少制造成本且增加稳定性。
[0270] 在一个实施方案中，对3' -突出端、5' -突出端或两者进行抗降解作用的稳定化。
[0271] 在一个实施方案中，RNA分子包含至少一个经修饰的核苷酸或其类似物。在一个 进一步的实施方案中，经修饰的核糖核苷酸在其糖、主链、碱基或三者的任何组合上是经修 饰的。
[0272] 在一个实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸。在一个进一步的实 施方案中，核苷酸类似物的2'-0!1基团由选自！1、01?、1?、卤素、3!1、31?、順2、順1?、置2或0~的 基团替代，其中每个R独立地是C1-C6烷基、链烯基或炔基，并且卤素是F、Cl、Br或I。
[0273] 在一个备选实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核 糖核苷酸。
[0274] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包含至少一个脱氧核苷酸。在一个进一步的 实施方案中，第一链包括1-6个脱氧核苷酸。在一个更进一步的实施方案中，第一链包括 1-3个脱氧核苷酸。在另一个实施方案中，3'-突出端包括1-3个脱氧核苷酸。在一个进一 步的实施方案中，5' -突出端包括1-3个脱氧核苷酸。在一个备选实施方案中，第二链包括 1-5个脱氧核苷酸。
[0275] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包括包含至少一个脱氧核苷酸的3' -突出端 或5' -突出端。在另一个实施方案中，RNA 3' -突出端和/或5' -突出端由脱氧核苷酸组 成。
[0276] 在一个实施方案中，双链体RNA分子与实体缀合。在一个进一步的实施方案中，实 体选自肽、抗体、聚合物、脂质、寡核苷酸和适体。
[0277] 在另一个实施方案中，第一链和第二链通过化学接头连接。
[0278] 4. 4. RNA分子的体内涕送
[0279] RNAi治疗应用的一个主要障碍是siRNA向革El细胞的递送（Zamore和Aronin， 2003)。已开发各种方法用于递送RNA分子，特别是siRNA分子（de Fougerolles等人，2007; Dykxhoorn等人，2003 ;Kim和Rossi，2007)。本领域技术人员已知的任何递送方法都可以 用于递送本发明的RNA分子。
[0280] 递送中的主要问题包括在血清中的不稳定性、非特异性分布、组织屏障和非特异 性干扰素应答（Lu&Woodle，Methods in Mol Biology 437:93-107(2008))。与其 siRNA 和 miRNA对应物比较，aiRNA分子具有几个优点，这些优点使得更广泛范围的方法能够用于递 送目的。首先，aiRNA可以设计为比其siRNA和miRNA对应物小，由此减少或消除任何干扰 素应答。其次，aiRNA更有力、开始得更快速、更有效且持续更久，因此为达到治疗目标需 要更少量/剂量的aiRNA。第三，aiRNA是双链的且比单链反义寡聚物和miRNA更稳定，并 且它们可以进一步进行化学修饰以增强稳定性。因此，本发明的RNA分子可以经由各种全 身或局部递送途径递送到受试者内。在某些实施方案中，本发明的分子通过全身递送途径 进行递送，包括静脉内（I.V.)和腹膜内（ip)。在其他实施方案中，本发明的分子通过局部 递送途径进行递送，例如鼻内、玻璃体内、气管内、脑内、肌内、关节内和肿瘤内。
[0281] 递送技术的例子包括裸RNA分子的直接注射、RNA分子与天然配体例如胆固醇或 适体的缀合、脂质体制剂的递送、和与抗体-鱼精蛋白融合蛋白的非共价结合。其他载体 选择包括带正电的载体（例如，阳离子脂质和聚合物）和各种蛋白质载体。在一个实施方 案中，本发明分子的递送使用基于阳离子脂质体复合物或聚合物复合物系统的配体靶向递 送系统（Woodle 等人 J Control Release 74 :309-311 ;Song 等人 Nat Biotechnol. 23(6): 709-717(2005) !Morrissey 等人 Nat Biotechnol. 23 (8) :1002-1007 (2005))。
[0282] 在一个实施方案中，本发明的分子用胶原载体例如atelocollagen进行配制，用 于体内递送。已报告atelocollagen保护siRNA免遭RNA酶降解，并且使得能够持续释 放（Minakuchi 等人 Nucleic Acids Res. 32 :el09 (2004) ;Takei 等人 Cancer Res. 64 : 3365-3370 (2004))。在另一个实施方案中，本发明的分子用纳米颗粒进行配制或形成纳米 乳液，例如R⑶肽配体靶向的纳米颗粒。已证实，不同的siRNA寡聚物可以组合在相同的RGD 配体革巴向纳米颗粒中，以同时革巴向几种基因（Woodle等人Materials Today 8(suppl 1): 34-41(2005))〇
[0283] 病毒载体也可以用于递送本发明的RNA分子。在一个实施方案中，慢病毒载体用 于递送RNA分子转基因，该转基因可以整合到基因组内用于稳定表达。在另一个实施方案 中，腺病毒和腺相关病毒（AAV)用于递送RNA分子转基因，该转基因不整合到基因组内并具 有附加型表达。
[0284] 此外，细菌可以用于递送本发明的RNA分子（Xiang等人，2006)。
[0285] 5.药物组合物和制剂
[0286] 本发明进一步提供药物组合物。该药物包括至少一种不对称双链体RNA分子作为 活性剂和一种或多种载体，所述载体选自药学载体、正电荷载体、脂质体、蛋白质载体、聚合 物、纳米颗粒、纳米乳液、脂质和类脂。在一个实施方案中，组合物用于诊断应用或用于治疗 应用。
[0287] 本发明的药物组合物和制剂，除RNA成分外，可以与针对siRNA、miRNA和反义RNA 开发的药物组合物和制剂相同或相似（de Fougerolles等人，2007 ;Kim和Rossi，2007)。这 些药物组合物和制剂中的siRNA、miRNA和反义RNA可以由本发明的双链体RNA分子替换。 药物组合物和制剂还可以进一步修饰，以适应本发明的双链体RNA分子。
[0288] 所公开的双链体RNA分子的"药学上可接受的盐"或"盐"是所公开的双链体RNA 分子的产物，其包含离子键，并且一般通过使所公开的双链体RNA分子与酸或碱反应而产 生，且适于施用给受试者。药学上可接受的盐可以包括但不限于，酸加成盐，包括盐酸盐、氢 溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、乙酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、 马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐和酒石酸盐；碱金属阳离子，例如Na、K、Li，碱土 金属盐，例如Mg或Ca，或有机胺盐。
[0289] "药物组合物"是以适于施用给受试者的形式包含所公开的双链体RNA分子的制 剂。在一个实施方案中，药物组合物是散装或单位剂型。单位剂型可以是各种形式，包括例 如胶囊、IV袋、片剂、气雾剂吸入器上的单栗、或小瓶。在单位剂量组合物中活性成分（例如 所公开的双链体RNA分子或其盐的制剂）量是有效量，可以根据所涉及的具体治疗而改变。 本领域技术人员将明了依赖于患者的年龄和状况，有时必须对剂量进行常规的改变。剂量 还取决于施用途径。可以考虑各种途径，包括经口、肺、直肠、肠胃外、经皮、皮下、静脉内、肌 内、腹膜内、鼻内等。用于本发明双链体RNA分子的局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾 剂、软膏、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。在一个实施方案中，活性双链体 RNA分子在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及需要的任何防腐剂、缓冲剂或抛射剂 混合。
[0290] 本发明提供治疗方法，其包括给有需要的受试者施用有效量的药物组合物。在一 个实施方案中，药物组合物经由选自iv、sc、局部、Po和ip的途径进行施用。在另一个实施 方案中，有效量是Ing至Ig/天、IOOng至Ig/天、或1 μ g至Img/天。
[0291] 本发明还提供药物制剂，其包括与至少一种药学上可接受的赋形剂或载体组合的 本发明双链体RNA分子。如本文所使用的，"药学上可接受的赋形剂"或"药学上可接受的载 体"意欲包括与药学施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等 渗剂和吸收延迟剂等。合适载体在"Remington :The Science and Practice of Pharmacy， 第 20 版，"Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA.中描述，其引入本文作为参 考。此类载体或稀释剂的例子包括但不限于水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、和5%人血 清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性媒介物，例如不挥发性油。此种介质和试剂用于药 学活性物质的使用是本领域众所周知的。除非任何方便的介质或试剂与活性双链体RNA分 子不相容，否则考虑其在组合物中的使用。增补性活性双链体RNA分子也可以掺入组合物 内。
[0292] 用于配制的方法公开于PCT国际申请PCT/US02/24262(W003/011224)、美国专利 申请公开号2003/0091639和美国专利申请公开号2004/0071775中，所述专利申请各自引 入本文作为参考。
[0293] 本发明的双链体RNA分子可以以通过下述方式制备的合适剂型进行施用：根据常 规工艺（即，通过产生本发明的药物组合物），将治疗有效量（例如，足以通过抑制肿瘤生 长、杀死肿瘤细胞、治疗或预防细胞增生性病症等达到所需疗效的有效水平）的本发明双 链体RNA分子（作为活性成分）与标准药学载体或稀释剂混合。这些工艺可以酌情地包括 混合、粒化和压片或溶解成分以获得所需制剂。在另一个实施方案中，治疗有效量的本发明 双链体RNA分子在不含标准药学载体或稀释剂的合适剂型中施用。
[0294] 药学上可接受的载体包括固体载体，例如乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果 胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。示例性液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、水等。类似 地，载体或稀释剂可以包括本领域已知的时间延迟材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸 甘油酯，单独地或连同蜡、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、甲基丙烯酸甲酯等。其他填充剂、 赋形剂、调味剂和其他添加剂，例如本领域已知的那些，也可以包括在本发明的药物组合物 中。
[0295] 包含本发明的活性双链体RNA分子的药物组合物可以以一般已知的方式进行制 造，例如借助于常规混合、溶解、粒化、锭剂制造、研末、乳化、封装、截留或冻干工艺。药物组 合物可以使用一种或多种生理可接受的载体，包括赋形剂和/或辅助剂，以常规方式配制， 所述载体可以促进活性双链体RNA分子加工成可以药学使用的制剂。当然，合适制剂依赖 于所选择的施用途径。
[0296] 本发明的双链体RNA分子或药物组合物可以通过目前用于化学治疗的许多熟知 方法施用给受试者。例如，对于癌症的治疗，本发明的双链体RNA分子可以直接注射到肿瘤 内、注射到血流内或体腔内或口服或用贴剂通过皮肤应用。对于银肩病的治疗，全身施用 (例如经口施用）或局部施用于受累的皮肤区域是优选的施用途径。所选择的剂量应足以 构成有效治疗，但又不高至引起无法接受的副作用。在治疗过程中和治疗后的一段合理时 期应紧密监视疾病（例如癌症、银肩病等）的状况和患者的健康。
[0297] 实施例
[0298] 下文提供了实施例以进一步举例说明本发明的不同特征。这些实施例还举例说明 对于实践本发明有用的方法。这些实施例对请求保护的本发明不构成限制。
[0299] RNA干扰（RNAi)是真核生物中催化性的基因特异性沉默机制，具有对生物学和医 学具有深远的意义（Fire等人，1998)，12。RNAi由RNA诱导的沉默复合物（RISC) (Hammond 等人，2000 ;Martinez和Tuschl，2004 ;Rana，2007)在掺入具有3'突出端的19-21个碱基 对（bp)的小干扰RNA(siRNA)后介导，所述siRNA是已知进入RISC内且介导RNAi的最小 RNA 双链体（Elbashir 等人，2001a ;Elbashir 等人，2001b ;Elbashir 等人，2001c ;Fire 等 人，1998 ;Zam〇re等人，2000)。作为RISC酶复合物的天然底物，siRNA可以化学合成或通 过Dicer催化加工其各种前体而产生（Donze和Picard，2002 ;Hammond等人，2000 ;Kim等 人，2005 ;Paddison等人，2002)。尽管广泛用于基因沉默，但siRNA的基因沉默效力有限， 对于哺乳动物细胞中的众多基因具有低沉默功效（de Fougerolles等人，2007 ;Iorns等 人，2007)。在此我们研究了在哺乳动物细胞中有效RNAi介体的结构支架需求。令我们惊 讶的是，我们发现具有双反义突出端的14-15bp不对称RNA双链体在哺乳动物细胞中可以 介导有力和有效的基因沉默。结构特征在于具有3'和5'反义突出端的14-15bp双链体 RNA的该不对称干扰RNA (aiRNA)，比siRNA更高效地掺入RISC内。该aiRNA在哺乳动物细 胞中引起序列特异性的mRNA切割和靶向的基因沉默。当靶向β -联蛋白mRNA的相同序列 时，aiRNA在体外介导基因沉默方面比siRNA更有效（接近100% )、有力（picoM)、快速开 始（小于24小时）和持久（高达1周）。这些结果说明，aiRNA是掺入RISC中的最小RNA 双链体支架并且是在哺乳动物细胞中比siRNA更有效地沉默基因的非siRNA型RNAi介体。 因此，aiRNA可以具有显著的广泛RNAi应用潜力。
[0300] 方法与材料
[0301] 细朐培养和试剂
[0302] 他1&、51480、00)1、！^29和！11299细胞得自八了0：，并且在包含10%胎牛血 清（FBS)、100单位/ml青霉素、100 μ g/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺（Invitrogen)的 Dulbecco氏改良Eagle氏培养基（DMEM)中培养。新鲜的外周血单核细胞（PBMC)得自 AllCells LLC，并且维持在包含 10 % FBS 和 pen/str印（Invitrogen)的 RPMI-1640 培养 基中。本研究中描述的小 RNA 由 Dharmacon、Qiagen 或 Integrated DNA technologies 合成（表2)，并且根据制造商的说明书进行退火（图3a)。靶向人Ag〇2和Dicer的 siRNA(Ambion)以IOOnM使用。使用DharmaFECTl (Dharmacon)以所不浓度执行RNA的转染。 使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染人 Argonaute2(Ago2)表达载体（OriGene)0 通过使aiRNA或siRNA双链体与10%人血清（Sigma) -起温育所示时间量，随后进行非变 性TBE-丙烯酰凝胶电泳和溴化乙啶染色，测定血清稳定性。
[0303] RNA印迹分析
[0304] 为了测定β -联蛋白的水平，在不同时间点用TRIZOL(Invitrogen)从siRNA或 aiRNA转染的Hela细胞中提取总RNA。将20 μ g总细胞RNA加载到变性琼脂糖凝胶的各泳 道。在电泳后，将 RNA 转移至 Hybond-XL Nylon 膜（Amersham Biosciences)，UV交联，并且 在 80°C烘烤 30 分钟。使用 Prime-It II Random Primer Labeling Kit(Stratagene)，由 β -联蛋白cDNA片段（I - 568nt)和肌动蛋白cDNA片段（l-500nt)，制备检测β -联蛋白 和肌动蛋白mRNA的探针。为了分析小RNA RISC装载，在用pCMV-Ag〇2转染后48小时，将 siRNA或aiRNA转染到Hela细胞内。细胞在所示时间点进行裂解，并且用Ago2抗体进行免 疫沉淀。洗涤免疫沉淀物，通过TRIZOL提取从复合物中分离RNA，并且加载到15 % TBE-Urea PAGE 凝胶（Bio-Rad)上。在电泳后，将 RNA 转移至 Hybond-XL Nylon 膜。mirVana miRNA Probe Kit(Ambion)用于产生 5'32P 标记的 RNA 探针。反义探针（5'-GUAGCUGAUAUUGAUGGA CUU-3'（SEQ ID N0:71))。有义探针（5, -UCCAUCAAU AUCAGC-3'（SEQ ID N0:72))
[0305] 体外 Ag〇2_RISC装载
[0306] aiRNA或siRNA有义和反义链使用T4激酶（Promega)进行32P末端标记。末端标 记的RNA通过苯酚/氯仿/异戊醇纯化，用EtOH沉淀，并重悬于水中。标记的RNA随后与所 述的siRNA或aiRNA反义链退火。对于体外裂解物，Hela细胞用人Ag 〇2表达载体转染24 小时，并且基本上如所述的（Dignam等人，1983)产生SlO裂解物。随后将5'有义链或反义 链标记的双链体aiRNA或siRNA加入Ago2-S10裂解物中。在37°C温育5分钟后，如所述 的免疫沉淀Ag〇2,在20 % TBE-丙烯酰胺凝胶上分离Ag〇2-结合的（沉淀）和Ag〇2-未结合 的（上清液）级分，用凝胶曝光胶片以检测有义链_Ag 〇2结合。对于aiRNA和siRNA竞争 实验，高达100倍的冷aiRNA和siRNA用于与32P标记的aiRNA或siRNA竞争装载至RISC。 简言之，由转染了所述Ag 〇2表达载体的Hela细胞产生SlO裂解物。随后将标记的aiRNA 或siRNA加入SlO裂解物中，紧接着加入未标记的aiRNA或siRNA。使反应在37 °C温育5 分钟，并且如上所述进行加工。
[0307] q RT-PCR
[0308] 在转染后所示时间点收获用所示aiRNA或siRNA转染的细胞。用TRIZOL分 离RNA，并且使用TaqMan -步RT-PCR试剂和用于所示mRNA的引物探针组（Applied Biosystems)执行qRT-PCR。数据相对于对照转染细胞呈现，并且每个样品相对于肌动 蛋白mRNA水平进行标准化。对于图14d中的实验，通过将Stat3 cDNA(Origene)克隆 到pcDNA3. Γ或pcDNA3. 1内的HindIII-Xhol位点，制备Stat3构建体。随后用Stat3 正向或反向表达载体与aiStat3或siStat3共转染Hela细胞24小时。随后收获细胞， 通过TRIZOL分离RNA，并且使用TaqMan -步RT-PCR试剂和用于Stat3或肌动蛋白的引 物探针组（Applied Biosystems)执行 qRT-PCR。使用 Superscript One-Step RT-PCR 试剂盒（Invitrogen)，以及 Stat3 正向（5, -GGATCTAGAATCAGCTACAGCAGC-3'（SEQ ID N0:73))和 Stat3 反向（5'-TCCTCTAGAGGGCAATCTCCATTG-3, （SEQ ID N0:74))引物， 以及肌动蛋白正向（5'-CCATGGATGATGATATCGCC-3'（SEQIDN0:75))和肌动蛋白反向 ( 5'-TAGAAGCATTTGCGGTGGAC_3'（SEQ ID NO:76))引物，对相同 RNA 样品执行 RT-PCR。
[0309] RT-PCR
[0310] 使用TRIZOL制备总RNA，并且使用随机引物用Thermoscript RT-PCR System(Invitrogen)合成 cDNA。PCR 使用 Pfx 聚合酶运行 20 个循 环。 引物： 肌动蛋白-1，5' CCATGGATGATGATATCGCC-3'（SEQ ID N0:75); 肌动蛋白-2,5'-TAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'（SEQ ID Ν0:76) ;β-联蛋 白-1，5' -GACAATGGCTACTCAAGCTG-Si (SEQ ID NO: 77) ;β_ 联蛋白 _2， 5'-CAGGTCAGTATCAAACCAGG-3'（SEQ ID Ν0:78)。
[0311] 蛋白质印迹
[0312] 细胞用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤2次，并且在裂解缓冲液（50mM HEPES、pH 7.5、0.5%Nonidet P-40、150mM NaClUmM EDTAUmM EGTAUmM原钒酸钠、ImM二硫苏糖醇、 1禮似?、21111苯甲基磺酰氟以及各1(^8/1111的胃酶抑素、亮抑酶肽和抑肽酶）中裂解。通 过SDS-PAGE分离20 μ g可溶蛋白质，并且转移至PVDF膜。在本研究中使用抗β-联蛋白、 NbsU存活蛋白、口21、1^