br>[0176] 在一个实施方案中，RNA分子的双链区不包含任何错配或凸起。在另一个实施方 案中，RNA分子的双链区包含错配和/或凸起。
[0177] 在一个实施方案中，当第一链是
[0178] 5' -UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU(SEQ ID N0:1)
[0179] 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG(SEQ ID N0:2)或
[0180] 5' -CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA(SEQ ID N0:3)时，
[0181] 第二链具有至多17个核苷酸的长度，或包含至少一个与第一链的错配，或包含至 少一个修饰。
[0182] 在一个备选实施方案中，第一链不是
[0183] 5' -UUCGAAGUAUUCCGCGUACGU(SEQ ID N0:1)
[0184] 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACGUG(SEQ ID N0:2)或
[0185] 5' -CGAAGUAUUCCGCGUACGUGA(SEQ ID N0:3)。
[0186] 在一个实施方案中，第一链包括与靶mRNA序列基本上互补的序列。在另一个实施 方案中，第二链包括与靶mRNA序列基本上互补的序列。
[0187] 本发明涉及能够实现基因沉默的不对称双链RNA分子。在一个实施方案中，本发 明的RNA分子包括第一链和第二链，其中第二链与第一链基本上互补或部分互补，并且第 一链和第二链形成至少一个双链区，其中第一链长于第二链（长度不对称）。本发明的RNA 分子具有至少一个双链区、以及独立地选自5' -突出端、3' -突出端和平头末端的2个末端 (例如，参见图1A，2A-2D)。
[0188] 在单个核苷酸的改变、添加和缺失可关键性地影响分子的功能性（Elbashir等 人，2001c)的小RNA调节剂制备领域中，aiRNA支架提供了与具有21-nt双链RNA的经典 siRNA结构不同的结构平台，经典siRNA结构在每条链及其相应的3'突出端上都是对称的。 此外，本发明的aiRNA提供一种非常需要的设计新型小分子调节剂的新方法，如下文实施 例中的数据显示的，该新型小分子调节剂可以克服目前在基于RNAi的研究和药物开发中 遇到的障碍。例如，自结构上模拟siRNA的aiRNA得到的数据显示，aiRNA在诱导基因沉默 方面比siRNA更有效、有力、快速开始、持久和特异。
[0189] 本发明RNA分子的任何单链区，包括任何末端突出和在2个双链区之间的缺口， 都可以通过化学修饰或二级结构进行抵抗降解的稳定化处理。RNA链可以具有未配对或不 完全配对的核苷酸。每条链可以具有一个或多个切口（在核酸主链中的切口，例如参见图 1B)、缺口（具有一个或多个缺失核苷酸的断裂链，例如参见图1C)、和经修饰的核苷酸或 核苷酸类似物。不仅RNA分子中的任何或所有核苷酸可以进行化学修饰，而且每条链可以 与一个或多个结构部分缀合以增强其功能性，所述结构部分例如一或多个肽、抗体、抗体片 段、适体、聚合物等等。
[0190] 在一个实施方案中，第一链比第二链长至少lnt。在一个进一步的实施方案中，第 一链比第二链长至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20扯。在另一 个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链 长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长3-10nt。
[0191] 在一个实施方案中，第一链或长链具有5-100nt、或优选10-30或12-30nt、或更优 选15-28nt的长度。在一个实施方案中，第一链长度是21个核苷酸。在一个实施方案中， 第二链或短链具有3-30nt、或优选3-29nt或10-26nt、或更优选12-26nt的长度。在一个 实施方案中，第二链具有15个核苷酸的长度。
[0192] 在一个实施方案中，双链区具有3_98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双 链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-19bp的长度。双 链区的长度可以是 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29 或 30bp。
[0193] 在一个实施方案中，RNA分子的双链区不包含任何错配或凸起，并且2条链在双链 区中彼此完全互补。在另一个实施方案中，RNA分子的双链区包含错配和/或凸起。
[0194] 在一个实施方案中，末端突出端是1-10个核苷酸。在一个进一步的实施方案中， 末端突出端是1-8个核苷酸。在另一个实施方案中，末端突出端是3nt。
[0195] 2. 1.在第一链上具有5' -突出端和3' -突出端的双链体RNA分子
[0196] 参考图1A，在本发明的一个实施方案中，双链RNA分子在第一链上具有5' -突出端 和3' -突出端。该RNA分子包括第一链和第二链；第一链和第二链形成具有基本上互补序 列的至少一个双链区，其中第一链长于第二链。在第一链上，在双链区侧翼，在5'和3'末 端上都存在未配对的突出端。
[0197] 在一个实施方案中，第一链比第二链长至少2nt。在一个进一步的实施方案中，第 一链比第二链长至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20扯。在另一个 实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二链长 2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长3-10nt。
[0198] 在一个实施方案中，第一链具有5-100nt的长度。在一个进一步的实施方案中，第 一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施 方案中，第一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-18个核苷酸的长度。
[0199] 在一个实施方案中，第一链具有10-30个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方 案中，第一链具有10-30个核苷酸的长度，并且第二链具有3-28个核苷酸的长度。在一个 更进一步的实施方案中，第一链具有10-30个核苷酸的长度，并且第二链具有3-19个核苷 酸的长度。
[0200] 在一个实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度。在一个进一步的实施方 案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-24个核苷酸的长度。在一个 更进一步的实施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-19个核苷 酸的长度。
[0201] 在一个实施方案中，第一链具有 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30拉的长度。在另一个实施方案中，第二链具有3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28nt 的长度。
[0202] 在一个实施方案中，第一链具有21nt的长度，并且第二链具有15nt的长度。
[0203] 在一个实施方案中，3' -突出端具有I-IOnt的长度。在一个进一步的实施方案中， 3'-突出端具有l_8nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，3'-突出端具有2-6nt的长 度。在一个实施方案中，3'-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10拉的长度。
[0204] 在一个实施方案中，5' -突出端具有I-IOnt的长度。在一个进一步的实施方案中， 5'-突出端具有l_6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，5'-突出端具有2-4nt的长 度。在一个实施方案中，5'-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10拉的长度。
[0205] 在一个实施方案中，3' -突出端的长度等于5' -突出端的长度。在另一个实施方案 中，3' -突出端长于5' -突出端。在一个备选实施方案中，3' -突出端短于5' -突出端。
[0206] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包括约15nt的基本上互补序列的双链区、 3-nt 3'-突出端和3-nt 5'-突出端。第一链是21nt并且第二链是15nt。在一个特征中， 各种实施方案的双链区由完全互补的序列组成。在一个备选特征中，双链区包括至少一个 切口（图1B)、缺口（图1C)或错配（凸起或环）。
[0207] 在一个实施方案中，双链区具有3_98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双 链区具有5-28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10-19bp的长度。双 链区的长度可以是 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29或30bp。可以存在一个以上双链区。
[0208] 在一个实施方案中，第一链是反义链，其能够靶向基本上互补的基因转录物例如 信使RNA(mRNA)，通过切割或通过翻译阻遏实现基因沉默。
[0209] 本发明还提供双链体RNA分子，其包括具有18-23个核苷酸长度的第一链和具有 12-17个核苷酸长度的第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且与第一链形成双链 区，其中第一链具有1-9个核苷酸的3' -突出端和1-8个核苷酸的5' -突出端，其中所述双 链体RNA分子能够在真核细胞中实现选择性基因沉默。在一个实施方案中，第一链包括与 靶mRNA序列基本上互补的序列。
[0210] 在一个实施方案中，第一链具有20、21或22个核苷酸的长度。在另一个实施方案 中，第二链具有14、15或16个核苷酸的长度。
[0211] 在一个实施方案中，第一链具有21个核苷酸的长度，并且第二链具有15个核苷酸 的长度。在一个进一步的实施方案中，第一链具有1、2、3、4、5或6个核苷酸的3' -突出端。 在一个更进一步的实施方案中，第一链具有3个核苷酸的3' -突出端。
[0212] 2. 2.具有一个平头末端以及在第一链h的5' -突出端或3' -突出端的双链体RNA 分子
[0213] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、一个平头末端和一个5' -突出端 或3' -突出端（参见例如图2A和2B)。该RNA分子包括第一链和第二链，其中第一链和第 二链形成双链区，其中第一链长于第二链。
[0214] 在一个实施方案中，双链区具有3_98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双 链区具有5_28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10_18bp的长度。双 链区的长度可以是 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29或30bp。双链区可以具有与就其他实施方案描述的特性类似的特性，故不必在此 重复。例如，双链区可以由完全互补的序列组成，或包括至少一个切口、缺口或错配（凸起 或环）。
[0215] 在一个实施方案中，第一链比第二链长至少lnt。在一个进一步的实施方案中，第 一链比第二链长至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20nt。在 另一个实施方案中，第一链比第二链长2〇-l〇〇nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第 二链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长4-10nt。
[0216] 在一个实施方案中，第一链具有5-100nt的长度。在一个进一步的实施方案中，第 一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施 方案中，第一链具有10_30nt的长度，并且第二链具有3-19个核苷酸的长度。在另一个实 施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-19个核苷酸的长度。
[0217] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、平头末端和3'-突出端（参见例 如图2B)。
[0218] 在一个实施方案中，3' -突出端具有I-IOnt的长度。在一个进一步的实施方案中， 3'-突出端具有l_8nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，3'-突出端具有2-6nt的长 度。在一个实施方案中，3'-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10拉的长度。
[0219] 在一个备选实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、平头末端和5'-突出端（参 见例如图2A)。
[0220] 在一个实施方案中，5' -突出端具有I-IOnt的长度。在一个进一步的实施方案中， 5'-突出端具有l_6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，5'-突出端具有2-4nt的长 度。在一个实施方案中，5'-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10拉的长度。
[0221] 2. 3.具有两个5' -突出端或两个3' -突出端的双链体RNA分子
[0222] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区、和两个3' -突出端或两个5' -突 出端（参见例如图2C和2D)。该RNA分子包括第一链和第二链，其中第一链和第二链形成 双链区，其中第一链长于第二链。
[0223] 在一个实施方案中，双链区具有3_98bp的长度。在一个进一步的实施方案中，双 链区具有5_28bp的长度。在一个更进一步的实施方案中，双链区具有10_18bp的长度。双 链区的长度可以是 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、29 或 30bp。
[0224] 在一个实施方案中，第一链比第二链长至少lnt。在一个进一步的实施方案中，第 一链比第二链长至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20扯。在另 一个实施方案中，第一链比第二链长20-100nt。在一个进一步的实施方案中，第一链比第二 链长2-12nt。在一个更进一步的实施方案中，第一链比第二链长4-10nt。
[0225] 在一个实施方案中，第一链具有5-100nt的长度。在一个进一步的实施方案中，第 一链具有5-100nt的长度，并且第二链具有3-30个核苷酸的长度。在一个更进一步的实施 方案中，第一链具有10_30nt的长度，并且第二链具有3-18个核苷酸的长度。在另一个实 施方案中，第一链具有12-26个核苷酸的长度，并且第二链具有10-16个核苷酸的长度。
[0226] 在一个备选实施方案中，双链体RNA分子包括双链区和两个3' -突出端（参见例 如图2C)。双链区具有与就其他实施方案所描述的类似特性。
[0227] 在一个实施方案中，3' -突出端具有I-IOnt的长度。在一个进一步的实施方案中， 3'-突出端具有l_6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，3'-突出端具有2-4nt的长 度。在一个实施方案中，3'-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10拉的长度。
[0228] 在一个实施方案中，双链体RNA分子包括双链区和两个5' -突出端（参见例如图 2D) 〇
[0229] 在一个实施方案中，5' -突出端具有I-IOnt的长度。在一个进一步的实施方案中， 5'-突出端具有l_6nt的长度。在一个更进一步的实施方案中，5'-突出端具有2-4nt的长 度。在一个实施方案中，5'-突出端具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10拉的长度。
[0230] 3. aiRNA的设计
[0231] SiRNA和miRNA已经广泛用作研究工具，并且被开发作为药物候选物。（参 见例如，Dykxhoorn，Novina&Sharp. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4:457-467(2003); Kim&Rossi， Nature Rev.Genet.8:173_184(2007) ;de Fougerolles 等人 Nature Rev. Drug Discov. 6:443-453(2007) ;Czech，NEJM354:1194-1195(2006);和 Mack，Nature Biotech. 25:631-638(2007))。本发明的双链体RNA分子，即aiRNA，可以衍生自本领域已知 的 siRNA 和 miRNA。
[0232] 本发明提供将siRNA或miRNA转化成aiRNA的方法。该转化导致与原始分子相比 具有至少一种改善的性质的新双链体RNA分子。该性质可以是大小、功效、效力、开始的速 度、持久性、合成成本、脱靶效应、干扰素应答或递送。
[0233] 在一个实施方案中，原始分子是双链体RNA分子，例如siRNA。该双链体RNA分子 包括形成至少一个双链区的反义链（例如引导链）和有义链（例如过客链）。该方法包括 改变一条或两条链的长度，从而使得反义链长于有义链。在一个实施方案中，有义过客链被 缩短。在另一个实施方案中，反义链被延长。在一个更进一步的实施方案中，有义链被缩短 并且反义链被延长。可以合成不变的或具有改变大小的反义和有义RNA链，并且随后在形 成aiRNA分子的条件下组合。
[0234] 在再一实施方案中，该方法包括改变反义和/或有义链的长度，从而使得形成具 有1-6个核苷酸的3' -突出端和1-6个核苷酸的5' -突出端中的至少之一的双链体RNA分 子。
[0235] 备选地，可以从头设计本发明的双链体RNA分子。利用SiRNA和miRNA的设计方 法，例如基因步移法，可以设计本发明的双链体RNA分子。
[0236] 本发明的RNA分子可以用生物信息学方法进行设计，并且随后在体外和体内进行 测试，以确定其对靶基因的调节功效和任何脱靶效应的存在。基于这些研究，随后可以选择 且修饰该RNA分子的序列，以改善对靶基因的调节功效和使脱靶效应最小化。（参见例如， Patzel, Drug Discovery Todayl2:139-148(2007))〇
[0237] 3. 1.双链体RNA分子中的未配对或错配冈域
[0238] aiRNA双链体的2条单链可以具有至少一个未配对的或不完全配对的（包含例如 一个或多个错配）区域。在一个实施方案中，未配对或不完全配对的区域是RNA分子的至 少一个末端区域，包括具有平头末端的末端区域、具有3'-凹缺或5'突出端的末端区域、和 具有5'凹缺或3'突出端的末端区域。如本文所使用的，末端区域是RNA分子中包括一个 末端和邻近区域的区域。
[0239] 在一个实施方案中，未配对或不完全配对的区域在aiRNA分子的双链区中。在一 个进一步的实施方案中，不对称RNA双链体具有未配对的凸起或环结构。
[0240] 3. 2.双链体RNA分子中的序列基序
[0241] 在本发明aiRNA分子的设计中，总体GC含量可以改变。在一个实施方案中，双链 区的GC含量是20-70 %。在一个进一步的实施方案中，双链区的GC含量小于50 %、或优选 30-50%，以使得链分离更容易，这是因为G-C配对强于A-U配对。
[0242] 在某些实施方案中，末端突出端，例如5'末端，的核苷酸序列可以独立于任何模 板序列（例如靶mRNA序列）进行设计，即不必与靶mRNA (在siRNA或miRNA模拟物的情况 下）或靶miRNA(在miRNA抑制剂的情况下）基本上互补。在一个实施方案中，较长链或反 义链的突出端，例如在5'或3'，是"AA"、"UU"或"dTdT"基序，其与某些其他基序比较已显 示出增加的功效。在一个实施方案中，较长链或反义链的5'突出端具有"AA"基序。在另 一个实施方案中，较长链或反义链的3'突出端具有"UU"基序。
[0243] 3. 3.核苷酸詈换
[0244] 本发明RNA分子中的一个或多个核苷酸可以用脱氧核苷酸或经修饰的核苷酸或 核苷酸类似物进行置换。置换可以在RNA分子中的任何地方发生，例如发生在一个或两个 突出端区域、和/或双链区。在某些情况下，置换增强RNA分子的物理性质，例如链亲和力、 溶解性和抵抗RNA酶降解的抗性或其他方面增强的稳定性。
[0245] 在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或类似物是糖、主链和/或碱基经修饰的核 糖核苷酸。主链经修饰的核糖核苷酸可以在与另一个核糖核苷酸的磷酸二酯键连接中具有 修饰。在一个实施方案中，RNA分子中的磷酸二酯键被修饰，以包括至少氮和/或硫杂原子。 在一个实施方案中，经修饰的核苷酸或类似物是稀有碱基或经修饰的碱基。在一个实施方 案中，经修饰的核苷酸或类似物是肌苷或三苯甲基化碱基。
[0246] 在再一实施方案中，核苷酸类似物是糖经修饰的核糖核苷酸，其中2' -OH基团由 选自H、OR、R、卤素、SH、SR、NH2、NHR、NRjP CN的基团替代，其中每个R独立地选自C1-C6 烷基、链烯基和炔基，并且卤素选自F、Cl、Br和I。
[0247] 在一个实施方案中，核苷酸类似物是包含硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核 苷酸。
[0248] 4.用涂
[0249] 本发明还提供调节细胞或生物中的基因表达的方法（沉默方法）。该方法包括步 骤：在可以发生选择性基因沉默的条件下，使所述细胞或生物与双链体RNA分子接触，和由 所述双链体RNA分子介导实现针对与双链RNA具有基本上对应的序列部分的靶核酸的选择 性基因沉默。
[0250] 在一个实施方案中，接触步骤包括将所述双链体RNA分子引入培养中的或生物体 中的靶细胞内的步骤，在所述靶细胞中可以发生选择性基因沉默。在一个更进一步的实施 方案中，引入步骤包括转染、脂转染、感染、电穿孔或其他递送技术。
[0251] 在一个实施方案中，该沉默方法用于确定基因在细胞或生物中的功能或用途。
[0252] 该沉默方法可以用于调苄基因在细胞或生物中的表达。在一个实施方案中，所述 基因与疾病例如人类疾病或动物疾病、病理状态或非期望状况相关。在一个进一步的实施 方案中，基因是致病微生物的基因。在一个更进一步的实施方案中，基因是病毒基因。在 另一个实施方案中，基因是肿瘤相关基因。
[0253] 在一个备选实施方案中，基因是与选自下述的疾病相关的基因：自身免疫疾病、炎 性疾病、退行性疾病、感染性疾病、增生性疾病、代谢疾病、免疫介导的病症、变应性疾病、皮 肤病学疾病、恶性疾病、胃肠道病症、呼吸病症、心血管病症、肾病症、类风湿性病症、神经学 病症、内分泌紊乱和衰老。
[0254] 4. 1.研究工具
[0255] 相对于基因工程敲除（knock-out)模型，本发明的RNA分子可以用于在动物模型 中造成基因"敲低"，以发现基因功能。该方法还可以用于在体外沉默基因。例如，可以向细 胞转染aiRNA。aiRNA可以在药物研究和开发中用作研究工具用于药物靶标/途径的鉴定 和验证、以及其他生物医学研究。
[0256] 4. 2治疗用涂
[0257] 本发明的RNA分子可以用于治疗和/或预防各种疾病或非期望状况，包括概述的 疾病（Czech，2006 ;de Fougerolles 等人，2007 ;Dykxhoorn 等人，2003 ;Kim和 Rossi，2007 ; Mack，2007)。
[0258] 在一个实施方案中，本发明可以用作癌症治疗或用于预防癌症。本发明的RNA分 子可以用于沉默或敲低涉及细胞增殖或其他癌症表型的基因。这些基因的例子是k-Ras、 β -联蛋白、Nbsl、EF2、Stat3、PTEN、p70S6K、mTOR、Rskl、PCNA、Parpl、存活蛋白、NQOl 和 P21。特别地，k-Ras和β-联蛋白是结肠癌的治疗基因。这些癌基因在大多数临床病例中 是活跃和相关的。
[0259] 这些RNA分子还可以用于沉默或敲低非癌基因靶。本发明的RNA分子还可以用于 治疗或预防眼疾病（例如老年性黄斑变性（AMD)和糖尿病性视网膜病变（DR));感染性疾 病（例如HIV/AIDS、乙型肝炎病毒（HBV)、丙型肝炎病毒（HCV)、人乳头瘤病毒（HPV)、单 纯疱疹病毒（HSV)、RCV、巨细胞病毒（CMV)、登革热、西尼罗病毒）；呼吸性疾病（例如呼吸 道合胞病毒（RSV)、哮喘、囊性纤维化）；神经学疾病（例如亨廷顿氏病（HD)、肌萎缩侧索硬 化（ALS)、脊柱损伤、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、疼痛）；心血管疾病；代谢病症（例如糖 尿病）；遗传病症；和炎性病状（例如，炎性肠病