buffer定容至450mL。底物二:0.015g pNPP溶于5mL异丙醇。底物一和二混合后备用。
[0040] 终止液(g ? kl) :NaOH 40g，邸TA钢盐93.05g。反应终止后加入62化。
[0041] 测定方法：
[0042] 在2.4mL的上述底物中，加入0.1 mL适当稀释的酶液（空白对照用稀释的失活酶液 代替），40°C条件下反应2min后测定410nm处的吸光度。
[00创酶活定义：
[0044] 40°C条件下每分钟产生Iwiiol对硝基苯酪的酶量为一个脂肪酶水解酶活单位。
[0045] 计算公式：
[0046] 酶活化? mL-i) = (VXA410X106)/(eXtXV'）
[0047] 其中：V-反应体积(mL) ; e-摩尔消光系数(ml ? mmol-1) ; t-反应时间（min); ￥'一酶液体积(1111^
[004引（2)气相色谱法测定脂肪醋化活力：
[0049]反应底物：
[(K)加]底物一:取48.5mL正辛酸加入250mL容量瓶，正庚烧定容。
[0化1] 底物二:取17.5mL无水乙醇加入250mL容量瓶，正庚烧定容。
[0052]内标；
[0化3] 2-己醇/庚烧（35g ? [I)
[0化4]标准样品：
[0化日]取IOg正辛酸乙醋加入1000 mL容量瓶，正庚烧定容。
[0化6]测定方法：
[0057]分别取ImL两种反应底物于5mL具塞塑料管中，加入约20mg脂肪酶粉(或冻干粉）， 40°C，150r ? mirTi下振荡反应30min。膜过滤或离屯、除去脂肪酶，取0.4mL滤液或上清液，加 入0.1 mL内标2-己醇，混匀，W气相色谱法根据辛酸乙醋标样与内标峰面积之比测定反应液 中辛酸乙醋的含量。
[005引气相色谱仪为Agilent 6820,色谱柱为AC20(PEG20000)，配备氨火焰离子检测器， W氮气为载气。气相色谱分析条件为:色谱柱初始溫度90°C，保持Imin，10°C ? mirTi升溫至 200°C，保持5min，检测器溫度250°C，进样器溫度250°C。
[0059] 酶活定义；
[0060] 在测定条件下，每分钟转化形成Iwnol辛酸乙醋所需的酶量定义为1个脂肪酶有机 相合成酶活单位。
[0061 ] A管/入才.
[0062]
[0063] 待测样品与内标峰面积之比
[0064] Afi;-标准标样与内标峰面积之比
[0065] S标一标准样品的浓度(g ? L-1)
[0066] V-反应液体积化）
[0067] 172-产物（正辛酸乙醋）分子量(g ? mol-i)
[006引 30-反应时间(min)
[0069] m-反应酶粉质量(mg)
[0070] 实施例1:膜环境复合物WTS的提取
[0071] 从培养好的华根霉菌体上利用化iton X-100、CHAPS、Tween 80、脱氧胆酸等表面 活性剂提取膜环境复合物及膜结合蛋白，然后通过美国bio-rad伯乐公司Bio-Beads SM-2 吸附剂吸附提取液中的表面活性剂使膜结合蛋白沉淀，经高速离屯、分离后所得上清液即为 膜环境复合物。具体方法如下：
[0072] 华根霉CCTCC M201021在马铃馨一葡萄糖琼脂培养基30°C培养3d，用无菌水洗下 抱子。200山抱子悬浮液接种到含20血发酵培养基的摇瓶(250mL^角瓶）中，于30°(：、15化? mirTi条件下培养72h。抱子悬浮液浓度约为IO7个? mri。菌体培养结束后，沙布过滤收集菌 丝体，W去离子水充分洗涂两次，再W25mmol -l/iipH 7.5的憐酸缓冲洗涂一次，-70°(：预冷 冻，冷冻干燥机冻干(约24h)，水分含量低于4%。冻干菌体称重作为菌体干重。
[0073] 将收集得到每克菌体加入IOmL丙酬溶剂中，于室溫下磁力揽拌30min，抽滤除去溶 剂，真空干燥过夜得到干燥的丙酬粉，于4°C下储存备用。然后将上述方法制得的将丙酬粉 每克悬浮于10倍体积的2.5mmol ? !/IpH 6.2憐酸缓冲液中，于室溫下磁力揽拌5min，经 1000化? min-i离屯、15min，沉淀重复上述步骤洗涂两次。将洗涂后得到的沉淀在悬浮于相同 体积含0.1%化iton X-IOO的2.5mmol ?L-ipH 6.2憐酸缓冲液当中，室溫下磁力揽拌5111；[]1， 1000 Or ? min-i离屯、15min，将所得沉淀悬浮于相同体积含去污剂1.5%T;riton X-IOO的 2.5mmol ? L-ipH6.2的憐酸缓冲液中，于4°C溫和振荡4h，于ISOOOr ? min-i下离屯、15min，得 到上清液作为膜结合脂肪酶粗酶液。在粗酶液中加入过量Bio-beads，4°C溫和振荡过夜， 12000r . mirTi离屯、30min，转移上清到新管中，上清即为膜成分复合体WTS，短期内4°C储存 备用。沉淀WTP用2.5mmol ? [IpH 6.2的憐酸缓冲液洗涂两次，W除去残余的Beads成份，4°C 下1200化? min-i离屯、5分钟，弃去上清收集沉淀，-20°C储存备用。
[0074] 实施例2:活性重塑方法
[0075] 按W下任意一种方法进行体外重折叠：
[0076] 方案A:在复性时添加膜环境复合物
[0077] (1)蛋白变性：取脂肪酶蛋白溶液或悬浮液，低溫震荡下每毫升溶液中缓慢加入 〇.5g研磨好的尿素粉末，4°C下磁力揽拌2-4h，每半小时取出10化L进行水解活性的测定，活 性完全丧失即判断S级结构完全打开形成肤链，蛋白全部变性。将变性蛋白1200化? mirTi 离屯、IOmin，取上清进行浓度测定，确保蛋白浓度不高于2.5mg ? ml/i，W保证蛋白能够完全 的进行复性。（2)蛋白复性：Wl: 1的体积比加入过量制备好的膜环境复合物，磁力揽拌5-IOmin充分混匀后，将蛋白溶液装入预处理好的透析袋中进行透析复性处理。将先将透析袋 放置于61尿素2.5111111〇1*1/1抑6.2复性透析缓冲液中，4°(：下溫和磁力揽拌3〇111山到4〇111111， 待透析袋内外盐平衡之后，将透析液更换为4M尿素2.5mmol ? !/IpH 6.2复性透析缓冲液，4 °(：下溫和磁力揽拌60min。待透析袋内外盐平衡后，将透析液更换为2M尿素2.5mmol ? !/IpH 6.2复性透析缓冲液，4°C下溫和磁力揽拌60min，待透析袋内外盐平衡后，将透析液更换为 不含尿素的2.5mmol ? L-Ip册.0复性透析缓冲液后(此步可进行若干次重复），4°C下溫和磁 力揽拌过夜透析。
[007引透析结束后将复性蛋白从透析袋中取出，于4°C下1200化.min-i离屯、lOmin，上清 液即为重折叠后的脂肪酶蛋白，4°C下短期保存备用。
[0079] 方案B:在变性时添加膜环境复合物
[0080] Wl: 1的体积比将制备好的膜环境复合物添加到脂肪酶蛋白溶液或悬浮液中，然 后再进行后续变性处理，而复性时不加膜环境复合物，其他步骤与方案A-致。
[0081 ]方案C:在复性时同时添加膜环境复合物和表面活性剂，其他步骤与方案A-致。
[0082] 方案D:在添加膜环境复合物的同时添加表面活性剂，其他步骤与方案B-致。
[0083] 实施例3:大肠杆菌异源表达华根霉成熟肤脂肪酶MPi活力的恢复
[0084] 根据华根霉脂肪酶全基因组序列设计引物，PCR扩增获得华根霉成熟肤脂肪酶基 因 A06672(华根霉基因组基因编号 http://genome. jgi .doe.gov/Rhichl/ 化i chI. home. html)连接表达载体6xHi S-MBP3-TEV-祀T15 (将pQ邸6MBP 中N端带有6xHi S标 签并含有TEV蛋白酶切位点的MBP融合蛋白基因片段(J.Am.化em. Soc.2012,134,375-385) 插入到PET15构建而成），转化E.COli化21trxB(DE3) ,IPTG诱导获得融合蛋白MBP(His)S-MPi，Hi sTrap纯化后经TEV蛋白酶酶切，再经由Hi sTrap和肥AE柱纯化得到纯酶MPi。
[0085] 按照实施例2的方案B和方案A分别进行变性时添加膜环境复合物和复性时添加膜 环境复合物活性重塑处理，处理后，蛋白溶液直接进行水解活性的测定，并取适量蛋白溶液 冻干为酶粉后进行醋化活性的测定。结果显示，运两个方案都能显著提供醋化活性，其中变 性时添加膜环境复合物进行活性重塑的方案B下，测得醋化活性由0.93U ? mg-i提高到 5.26U ? mg-i，提高了 5.6倍，醋化活性总活力回收率达到441 % (如表1所示）。
[0086] 表1活性重塑前后外源表达华根霉成熟肤脂肪酶的醋化活性和水解活性对比
[0087]
[C
[0089] 实施例4:大肠杆菌异源表达华根霉成熟肤脂肪酶MPl包涵体活力的恢复
[0090] 根据华根霉脂肪酶全基因组序列设计引物，PCR扩增获得华根霉成熟肤脂肪酶基 因 A06672(华根霉基因组基因编号 http://genome. jgi .doe.gov/Rhichl/ 化1油1.home.html)连接表达载体祀T-22b转化E. coli化21 (DE3)，IPTG诱导后收集菌体， 细胞破碎离屯、后获得外源表达蛋白MPl包涵体。
[0091] 将包涵体蛋白悬浮于憐酸缓冲液中，按照实施例2的方案B和方案A分别进行变性 时添加膜环境复合物和复性时添加膜环境复合物活性重塑处理，进行活性重塑处理后，蛋 白溶液直接进行水解活性的测定，并取适量蛋白溶液冻干为酶粉后进行醋化活性的测定。 结果如表2所示，测得醋