一组1型和新血清型鸭肝炎病毒的rt-pcr鉴别诊断引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组区别1型和新血清型鸭肝炎病毒的RT?PCR鉴别诊断引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1?2所示。该引物根据1型和新血清型鸭肝炎病毒全基因组序列的3’?端核苷酸序列存在差异来设计，该组引物在扩增1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的特异性扩增区域核苷酸序列存在长短差异来进行鉴别诊断，其中1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片段大小为321bp左右。利用本发明所述引物的鉴定方法操作简单快速，准确率高，仅需一组引物就能区分1型和新血清型鸭肝炎病毒感染类型，为水禽业健康养殖提供技术保证。
【专利说明】
-组1型和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物
技术领域
[0001] 本发明属于兽医传染病快速诊断技术领域，具体设及一组区别1型鸭肝炎病毒和 新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物。
【背景技术】
[0002] 1型鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)是由鸭肝炎病毒引起的 一种急性、高度接触性传染病，主要侵害3周龄内维鸭，W肝炎为典型特征。该病发病急、病 程短、发病率和死亡率高，严重威胁养鸭业健康发展[杨维星，施少华，陈红梅，等.3株鸭肝 炎病毒1型全基因序列分析[J].中国农学通报，2010,26(14) :8-12.]。
[0003] 1999年中国农业大学苏敬良等从发病的北京鸭和樓桃谷鸭中分离到2株与1型鸭 肝炎病毒无血清学相关性的鸭肝炎病毒新血清型（Duck hepatitis virus new serotype， DHV-N)。本团队施少华等对鸭肝炎病毒新血清型DHV-N G株进行了基因组序列测定，发现鸭 肝炎病毒新血清型G株和鸭肝炎病毒1型的5'UTR和3'UTR相比，发生了较大的插入与缺失现 象，并明确鸭肝炎病毒1型和新血清型存在较大差异[施少华，程龙飞，傅光华，等.鸭肝炎病 毒新血清型基因组序列分析[J].微生物学报，2009,49(3):309-315.]。
[0004] 目前，关于1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒病原学检测的RT-PCR鉴别诊断 方法均有相关报道。但相关方法均需要针对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒特异性 核巧酸序列分别设计特异性引物，建立双重PCR鉴别诊断方法，但双重PCR条件优化较为繁 琐，对操作者要求较高。本发明提供的方法仅需一组引物(比分别设计特异性引物检测时少 1组引物），该引物根据1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒全基因组序列在3'-端存在长 短差异来设计引物;该组引物可同时对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒进行有效扩 增，且引物扩增的1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒区域核巧酸序列存在长短差异来 进行区分，其中1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp，新血清型鸭肝炎病毒扩增片段大小 为321bp左右，根据1型和新血清型鸭肝炎病毒扩增的目的片段大小差异来对1型和新血清 型鸭肝炎病毒感染进行检测。本发明的方法操作简单，无需复杂繁琐的条件优化过程，本发 明在1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒病原学检测上快捷准确，可填补国内外相关领 域研究空白。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR引 物。该引物能有效区分1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒感染(或共感染），为水禽业健 康养殖提供技术保证。
[0006] 本发明的目的通过如下技术方案实现： 一组区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物，所述引物的 序列如下： 上游引物P1:5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。
[0007] 所述的引物需要对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒均可进行RT-PCR扩增， 且在该扩增区域1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒存在核巧酸片段长短差异，其中1型 鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片段大小为32化P左右。
[0008] 如图1所示，本发明设计的上游引物在1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒保守 区设计的；如图2所示，本发明设计的下游引物在1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒保 守区设计的。本发明设计的上下游引物可同时对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒进 行扩增。如图2所示，本发明设计的上下游引物对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒进 行扩增时，扩增区域存在核巧酸差异（见图2差异区，其中1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为 258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片段大小为32化P左右）。
[0009] 从图3所示，图1和图2选取的1型鸭肝炎病毒(DHV-1)和新血清型鸭肝炎病毒(DHV- N)均符合要求，可代表GenBank中相关病毒的特征。
[0010] 一组区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR检测方法，利用上游引 物P1:5' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3'和下游引物P2:5' - TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'建 立基于1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒基因组3'-端差异区设计，引物对1型鸭肝炎 病毒和新血清型鸭肝炎病毒核酸RNA进行RT-PCR扩增后的产物1型鸭肝炎病毒扩增片段大 小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片段大小为32化P左右(如图4所示）。
[0011] 具体包括W下步骤： 1) 按照常规方法提取1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的核酸RNA; 2) 利用上游引物Pl:5'- AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3'和下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'，同时对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒进行RT-PCR检 测，反应完成后进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定； 3) 根据RT-PCR扩增的产物大小可直接对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒感染进 行鉴别诊断，其中1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片 段大小为32化P左右。
[0012] 所述引物在制备检测1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒试剂中的的应用。
[0013] 较之现有技术而言，本发明的优点在于:本发明鉴定方法简单，快捷和准确率高： 本发明对12份临床采集的肝炎症状死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR检测， 经琼脂糖凝胶电泳可见看出有1型鸭肝炎病毒阳性病料2份，阳性率为16.67%(2/12);新血 清型鸭肝炎病毒阳性病料5份，阳性率为41.67%(5/12)，未检测到12份样品存在共感染现 象;本发明仅需上游引物P1和下游引物P2运一组引物即可对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭 肝炎病毒感染进行鉴别诊断，无虚复杂繁琐的条件优化过程，本发明在1型鸭肝炎病毒和新 血清型鸭肝炎病毒快速鉴别诊断检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明设计的上游引物在1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒保守区基 因分析图。
[0015] 图2是本发明设计的下游引物在1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒保守区基 因分析图和本实验设计的引物扩增1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的差异区基因分 析图。
[0016] 图3是图1和图2选取的1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒遗传进化分析图。从 结果可见，本发明选取的代表株具有代表性。根据上述代表株设计的特异性上下游引物符 合实验预期。
[0017] 图4是利用引物P1和P2进行对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒RT-PCR扩增 的电泳图。其中：1: DHV-1; 2: DHV-N; 3:空白对照;Μ: DL2000 DNA分子量标准。
[0018] 图5是引物Ρ1和Ρ2特异性检测的电泳图。其中：1:禽流感病毒;2:禽1型副粘病毒； 3:呼肠孤病毒;4:禽坦布苏病毒;5:鸭圆环病毒;6:鸭攝病毒;7:番鸭细小病毒;8:新血清型 鸭肝炎病毒:9:1型鸭肝炎病毒；M:DL2000 DNA分子量标准。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合说明书附图和实施例对本
【发明内容】
进行详细说明： 一组区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物及检测方法， 所述引物的序列如下： 上游引物P1:5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。
[0020] 一组区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR检测方法，它包括W下 步骤： 1) 提取1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的核酸RNA; 2) 利用上游引物Pl:5'- AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3'和下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'，同时对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒进行RT-PCR检 测，反应完成后进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定； 3) 根据RT-PCR扩增的产物大小可直接对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒感染进 行鉴别诊断，其中1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片 段大小为32化P左右。
[0021] 所述的一组区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物及 检测方法，其特征在于:所述RT-PCR检测的反应体系为： 在20化体系中加入W下成分：
步骤2)中所述基RT-PCR检测设置的反应条件为:45 °C反转录30min后进行PCR反应， 94 °C预变性5min ;随后进行94°C 50s、54°C 30s、72°C 30s，进行40个循环后72°C延伸 lOmin。反应结束后，经常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0022] 实施例1 1材料与方法： 1.1实验试剂与耗材：病毒核酸RNA提取试剂盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)、RT- PCR试剂盒(EasyScript One-St巧RT-PCR SuperMix)购自北京全式金生物技术有限公司， 实时PCR购自AXYGEN公司； 1.2实验毒株： 1型鸭肝炎病毒（DHV-l)(GenBank号JX390983)和新血清型鸭肝炎病毒（DHV-N) (GenBank号抓755009)、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒、鸭圆环病 毒、鸭攝病毒和番鸭细小病毒均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离鉴定和保存。
[0023] 1.3 方法： 1.3.1 RT-PCR的引物设计： 利用01ig〇7对其进行引物设计，该对引物设计时需要对DHV-1和DHV-N均可同时进行扩 增，且在该扩增区域DHV-1和DHV-N存在核巧酸序列长度差异，所述的引物为： 上游引物P1:5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。
[0024] 其中1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒扩增片段大 小为32化P左右。
[0025] 1.3.2 RT-PCR的检测的反应体系和反应条件的优化： 所述RT-PCR检测的反应体系为： 在20化体系中加入W下成分：
步骤2)中所述基RT-PCR检测设置的反应条件为:45 °C反转录30min后进行PCR反应， 94 °C预变性5min ;随后进行94°C 50s、54°C 30s、72°C 30s，进行40个循环后72°C延伸 lOmin。反应结束后，经常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。如图4所示:从图4可知:仅1型鸭肝炎病毒 (DHV-lKGenBank 号 JX390983)和新血清型鸭肝炎病毒（DHV-N)(GenBank 号抓755009)可 W RT-PCR扩增。从图4可见，1型鸭肝炎病毒扩增片段大小为258bp左右，新血清型鸭肝炎病毒 扩增片段大小为32化P左右。
[0026] 1.3.3特异性实验 用本研究设计的引物(上游引物P1和下游引物P2)对鸭群常见传染病如禽流感病毒、禽 1型副粘病毒、呼肠孤病毒、禽坦布苏病毒、鸭圆环病毒、鸭攝病毒和番鸭细小病毒核酸进行 检测，均未出现特异性条带扩增，检测结果均未阴性，仅1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎 病毒核酸出现特异性扩增(见图5)，表明本研究设计的引物具有极强的特异性。
[0027] 1.3.4临床应用 利用本发明提供的一组区别1型和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物及检测 方法对12份临床采集的肝炎症状死亡鸭病料进行检测，提取核酸RNA后进行RT-PCR检测，经 琼脂糖凝胶电泳可见看出有1型鸭肝炎病毒阳性病料2份，阳性率为16.67%(2/12);新血清 型鸭肝炎病毒阳性病料5份，阳性率为41.67%巧/12)，未检测到12份样品存在共感染现象； 本发明仅需上游引物P1和下游引物P2运一组即可对1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒 进行鉴别，无虚复杂繁琐的条件优化过程，本发明在1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒 快速鉴别诊断检测上快捷准确，可填补国内外相关领域研究空白。
[002引 1.3.5结果验证 将上述鉴定为1型鸭肝炎病毒阳性病料2份、新血清型鸭肝炎病毒阳性病料5份，用文献 使用的RT-PCR方法进行重复检测验证。1型鸭肝炎病毒阳性病料2份使用文献[杨维星，施少 华，陈红梅，等.3株鸭肝炎病毒1型全基因序列分析[J].中国农学通报，2010,26( 14):8- 12.]进行检测，结果和本研究的方法一致，符合率为100%。新血清型鸭肝炎病毒阳性病料5 份，用文献使用的RT-PCR方法进行重复检测验证。新血清型鸭肝炎病毒阳性病料5份使用文 献[施少华，程龙飞，傅光华，等.鸭肝炎病毒新血清型基因组序列分析[J].微生物学报， 2009,49(3):309-315.]进行检测，结果和本研究的方法一致，符合率为100%。
[0029] W上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与 修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一组区别1型鸭肝炎病毒和新血清型鸭肝炎病毒的RT-PCR鉴别诊断引物，其特征在 于:所述引物的序列如下： 上游引物PI: 5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'_ TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。2. 如权利要求1所述引物在制备检测1型和新血清型鸭肝炎病毒试剂中的的应用。
【文档编号】C12Q1/70GK106011315SQ201610657565
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月12日
【发明人】万春和, 施少华, 黄瑜, 程龙飞, 傅光华, 陈红梅, 傅秋玲, 陈翠腾, 刘荣昌
【申请人】福建省农业科学院畜牧兽医研究所