一株产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌th-2及其用途
【专利摘要】一株产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2及其用途。本发明菌株是从胜利油田油水井样品中通过血平板和扩油圈方法筛选得到，并通过耐温耐盐性能考察反复筛选传代获得，其命名为Bacillus subtilis.TH-2，其保藏编号为CGMMCC No.8695。该菌培养基为葡萄糖20g/L，尿素3g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钠5g/L，pH值为7.0～7.5。本发明提供的TH-2菌好氧、最适生长温度37～50℃、生长pH值范围4～9、最佳生长pH范围7.0～7.5、NaCl的耐受性0～3％。该菌发酵生产的脂肽类表面活性剂性能为耐温150℃、耐盐15×104mg/L、乳化指数大于80％、表面张力最低27mN/m、物理模拟实验提高采收率大于12％。该菌株发酵液和发酵液的粗提产品现场试验提高采收率分别大于5.0％和8.0％。因此，本发明提供的TH-2菌发酵生产的酯肽类表面活性剂可广泛地应用于提高原油采收率的现场试验中。CGMCC No86952014.01.09
【专利说明】一株产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2及其用途 一、
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物生物技术和环境生物【技术领域】，具体地说，它涉及一株枯草芽 孢杆菌Baci I lus subti I i s. TH-2菌株及其在微生物采油中的应用。 二、
【背景技术】
[0002] 在能源日趋紧张的情况下，提高石油采收率已成为石油开采研究的焦点，近年来 三次采油技术日益得到广泛重视和现场应用，因此，三次采油驱油剂的研发也越来越引起 科研工作者的关注，现在常用的驱油剂主要以化学表面活性剂，如：石油磺酸盐、烷基苯磺 酸盐和石油羧酸盐等。
[0003] 目前，石油开采中驱油剂以化学表面活性剂为主，但由于化学表面活性剂耐温耐 盐性能与油藏适应性差，产量降低，生产成本较高，环境污染，表/界面活性较差等问题，因 此在一定程度上限制了其在现场应用。
[0004] 生物表活剂与化学表活剂相比具有如下优势：首先，它们与一般的表面活性剂分 子在结构上相似，在分子中不仅有脂肪烃链构成的非极性憎水基，而且含有极性的亲水基， 但生物表面活性剂通常比合成表面活性剂拥有更为复杂和庞大的分子结构，单个分子占据 更大的空间，而显示较低的临界胶团浓度；其次，它们能显著地降低表面张力、改善界面性 质，在极端苛刻条件下仍具有良好的选择性和专一性，相容性好，无毒，能被微生物降解， 因此具备高效、环保的特性，并且不以石油为原料，在石油开采、环境治理等领域应用越来 越广泛。特别是在石油开采过程中可以直接利用微生物发酵液，省去分离纯化过程，因而可 大幅度降低成本，较石化产品有明显的价格优势。 三、
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtil is) TH-2菌株和该菌在微生物采油中的应用。
[0006] 本发明提供的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)TH-2菌株，以下简称TH-2,于 2014年1月9日保藏于"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"（北京市朝阳 区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），其保藏编号为CGMCC No. 8695。
[0007] 本发明提供的枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695菌株，是从胜利油田油水井样品 中通过血平板和扩油圈方法筛选得到，并通过耐温耐盐性能考察反复筛选传代获得。
[0008] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695的形态学特性：在好氧固体培养基下 培养1?2天出现大小一般为0.5?LOmm乳白色菌落，细胞形态为短杆状，大小 2-5 UmX 0· 5-1. Oum0
[0009] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695的生理生化特性：好氧，生长温度37?50°C， 生长pH值范围4?9,最佳生长pH范围7?7. 5, NaCl的耐受性0?3%。
[0010] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695的营养培养基：葡萄糖20g/L，尿素3g/L，酵母 粉lg/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钠5g/L，pH值为7. 0-7. 5。
[0011] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695发酵条件：接种量8%，接种龄12h，初始ρΗ7· 5， 温度37°C，搅拌速度200rpm，pH = 7,体积15m3,通气量：2L/min。
[0012] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695在常温常压、上述营养培养基和发酵条件下产 量最高达到2. 4g/L。
[0013] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695发酵液的性能评价参数：耐温性、耐盐性、乳化 性能、表面张力、物理模拟实验提高采收率值。
[0014] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695发酵生产的脂肽类表面活性剂的性能参数评价 方法：
[0015] (1)耐温性能测定
[0016] 取已经配制好的不同浓度表面活性剂溶液，在恒温器中加热到150°C维持两个小 时后，60°C下测其表界面张力。
[0017] ⑵耐盐性能测定
[0018] 分别用不同浓度的NaCl溶液配制生物表活剂，配制后观察是否有浑浊和沉淀产 生。
[0019] ⑶乳化性能测定
[0020] 以石蜡做模型油相，配制不同浓度的生物表面活性剂溶液，分别将25mL的生物表 面活性剂溶液与25mL油相加入到50mL的比色管中，然后在震荡器上充分混合3min后，在 60°C下静止，记录乳化情况。
[0021] (4)表面张力测定
[0022] 用蒸馏水将液体样品配制成质量分数为1 %的溶液，固体样品配制成质量分数为 0. 3%的溶液，按GB/T5549的规定用挂片法测定。
[0023] (5)物理模拟驱油评价
[0024] ①填装模拟岩心；
[0025] ②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙度；
[0026] ③饱和原油，岩心老化7天；
[0027] ④一次水驱，水驱至采出水含水98%以上，计算一次水驱采收率；
[0028] ⑤注入该菌发酵生产的生物表面活性剂产品0. 2PV?0. 3PV ;
[0029] ⑥二次水驱，水驱至含水100%以上，计算该菌发酵产物提高采收率值。
[0030] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695发酵生产的脂肽类表面活性剂性能：耐温 150°C，耐盐15X104mg/L，乳化指数大于80%，表面张力最低27mN/m，物理模拟实验提高采 收率大于12%。
[0031] 枯草芽孢杆菌TH-2CGMCC No. 8695发酵生产的脂肽类表面活性剂的现场应用工 艺：一种是直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油；另一种是将发酵液中 的表面活性剂进行粗提，然后将粗提的生物表面活性剂产品注入到油藏中进行驱油。
[0032] 所述将发酵液中表面活性剂进行粗提的方法：在发酵液中加入盐酸将pH值调到 2. 0,利用超滤膜过滤后收集沉淀物。
[0033] 所述的利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，是将发酵液与注入 水按照体积比为1:800?1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙体积的 20%?30%，注入速度为1501113/(1?2001113/(1。
[0034] 所述的将粗提生物表面活性剂产品注入到油藏中进行驱油，是将粗提的生物表面 活性剂产品与注入水按照体积比为1:5000?6000比例混合后注入油藏，混合液注入总量 为油藏孔隙体积的20%?30 (%，注入速度为15〇1113/(1?20〇1113/(1。
[0035] 本发明的优点和积极效果在于：
[0036] 本发明提供的CGMCC No. 8695菌在最适温度37?50°C和pH值7. 0?7. 5条件 下，发酵产生脂肽类生物表面活性剂，产量最高2. 4g/L，耐温150°C，耐盐15 X 104mg/L，乳化 指数大于80 %，表面张力最低27mN/m，物理模拟实验提高采收率大于12 %，该菌株发酵液 和发酵液的粗提产品应用于现场试验，提高采收率分别大于5. 0%和8. 0%。 四、
【专利附图】
【附图说明】
[0037] 附图1为TH-2菌株的形态结构图；
[0038] 附图2为TH-2发酵生产的脂肽溶液表面张力测试结果；
[0039] 附图3为TH-2发酵液对柴油的乳化性能测试结果；
[0040] 附图4为TH-2产脂肽类生物表面活性剂的耐温性能测试结果；
[0041] 附图5为TH-2产脂肽类生物表面活性剂耐盐性能测试结果。 五、
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
[0043] 实施例1 :
[0044] 本发明提供的枯草芽孢杆菌TH-2的形态特征和生理生化特征
[0045] 参照《Bergey's Mannual ofSystematic Bacteriology》的实验方法进行，检测器 革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，以及触酶、淀粉水解、明胶液化、 半乳糖、木糖、乳糖等生化特征。
[0046] 研究结果表明，如图1所示，该菌株为革兰氏染色阳性、菌体呈短杆状、周生鞭毛、 能运动、好氧、有芽孢生成，细胞大小3 μ mXO. 5 μ m，大多数菌体呈散状。生长温度20? 50°C，最适生长温度30°C，生长pH范围4?9, NaCl耐受性0?3%。接触酶、淀粉水解酶、 明胶液化、麦芽糖、D-半乳糖、a -D-葡萄糖、柠檬酸、D-松三糖、蔗糖、D-海藻糖均表现为 阳性，D-阿拉伯醇、山梨醇、琥珀酸、L-亮氨酸、龙胆二糖等均表现为阴性。
[0047] 实施例2 :
[0048] 本发明提供的枯草芽孢杆菌ΤΗ-2培养发酵及发酵液性能评价
[0049] 发酵培养基：葡萄糖20g/L，尿素3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢二钾3g/L，NaC15g/L。
[0050] 发酵条件：为接种量8%，接种龄12h，初始ρΗ7· 5,温度30°C，搅拌速度：250rpm， pH = 7,体积15m3,通气量：2L/min，培养24小时后评价。
[0051] 发酵液的性能参数评价方法：
[0052] (1)耐温性能测定
[0053] 取已经配制好的不同浓度表面活性剂溶液，在恒温器中加热到150°C维持两个小 时后，60°C下测其表界面张力。
[0054] (2)耐盐性能测定
[0055] 分别用不同浓度的NaCl溶液配制生物表活剂，配制后观察是否有浑浊和沉淀产 生。
[0056] (3)乳化性能测定
[0057] 以石蜡做模型油相，配制不同浓度的生物表面活性剂溶液，分别将25mL的生物表 面活性剂溶液与25mL柴油加入到50mL的比色管中，然后在震荡器上充分混合3min后，在 60°C下静止，记录乳化情况。
[0058] (4)表面张力测定
[0059] 用蒸馏水将液体样品配制成质量分数为1 %的溶液，固体样品配制成质量分数为 0. 3%的溶液，按GB/T5549的规定用挂片法测定。
[0060] (5)物理模拟驱油评价
[0061] ①填装模拟岩心；
[0062] ②抽真空、饱和地层水，测定岩心孔隙度；
[0063] ③饱和原油，岩心老化7天；
[0064] ④一次水驱，水驱至采出水含水98%以上，计算一次水驱采收率；
[0065] ⑤注入该菌发酵生产的生物表面活性剂产品0. 2PV?0. 3PV ;
[0066] ⑥二次水驱，水驱至含水100%以上，计算该菌发酵产物提高采收率值。
[0067] 实验结果表明（见附图2?图5)，该菌种发酵产生脂肽产量最高达到2. 4g/L，表 面张力为25mN/m，最高耐温150°C，耐盐15. OX 104mg/L，乳化指数92. 5%，物理模拟实验 提高采收率值见表1。
[0068] 表I TH-2菌株代谢产物物理模拟提高原油采收率性能评价结果
[0069]
【权利要求】
1. 一株产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2,已于2014年1月9日保藏于"中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"，命名为Bacillus subtilis. TH-2,其保藏编号 为 CGMMCC No. 8695。
2. 根据权利要求1所述的产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2,其特征在于，所述 菌株形态学特性为好氧固体培养基下培养1?2天出现大小为0. 5mm?1. 0mm乳白色菌落， 细胞形态为短杆状，大小2?5 μ mXO. 5?1. 0 μ m ;生理生化特性为好氧，生长温度37°C? 50°C，生长pH值范围4?9，NaCl的耐受性0%?3% ;其营养培养基为葡萄糖20g/L，尿素 3g/L，酵母粉lg/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钠 5g/L，pH值为7. 0?7. 5 ;其发酵条件为接种 量8%，接种龄12h，初始ρΗ7· 5,温度37°C，搅拌速度200rpm，pH = 7,体积15m3,通气量：2L/ min〇
3. 根据权利要求2所述的产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2,其特征在于，所述 菌株生长pH值范围为7?7. 5。
4. 根据权利要求1所述的产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2,其特征在于，所述 菌株发酵液性能为耐温150°C，耐盐15X 104mg/L，表面张力最低27mN/m。
5. 根据权利要求1?4中任一项权利要求所述产耐高温高盐脂肽枯草芽孢杆菌TH-2 在微生物采油中的应用，其特征在于，所述的应用工艺包括以下两种：（1)直接利用发酵液 与油田注入水混合注入油藏中进行驱油；（2)将发酵液中的表面活性剂进行粗提，然后将 粗提的生物表面活性剂产品注入到油藏中进行驱油。
6. 根据权利要求5所述产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2在微生物采油中的 应用，其特征在于：所述将发酵液中表面活性剂进行粗提，其方法是在发酵液中加入盐酸将 pH值调到2. 0,利用超滤膜过滤后收集沉淀物。
7. 根据权利要求5所述产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2在微生物采油中的应 用，其特征在于，所述的直接利用发酵液与油田注入水混合注入油藏中进行驱油，是将发酵 液与注入水按照体积比为1:800?1000比例混合后注入油藏，混合液注入总量为油藏孔隙 体积的20%?30%，注入速度为150111 3/(1?2001113/(1。
8. 根据权利要求5所述产耐高温高盐脂肽的枯草芽孢杆菌TH-2在微生物采油中的应 用，其特征在于，所述的将发酵液中生物表面活性剂粗提注入到油藏中进行驱油，是将粗提 的生物表面活性剂产品与注入水按照体积比为1:5000?6000比例混合后注入油藏，混合 液注入总量为油藏孔隙体积的20%?30%，注入速度为150111 3/(1?2001113/(1。
【文档编号】C09K8/584GK104263681SQ201410455701
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】林军章, 宋欣, 王静, 高光军, 谭晓明, 冯云, 曹功泽, 张守献, 宋永亭, 汪卫东, 曹嫣滨 申请人:中国石油化工股份有限公司, 中国石油化工股份有限公司胜利油田分公司采油工艺研究院