专利名称：hMCP－DAF融合基因及其编码的多肽和构建方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，尤其涉及hMCP-DAF融合基因及其编码的多肽和构建方法。
背景技术：
器官移植被证明是一个拯救和延长生命的有效办法，有时还是唯一的办法。在世界范围内，人类同种器官移植始于50年代。但世界范围内供体器官的短缺一直困扰着器官移植的临床研究与应用，世界各大医院每年都有许多等待不到器官移植的人死亡。这种状况一直刺激着科学家对非人源器官移植的可能性研究，这种研究自八十年代后期成为一世界性热点。几个世纪以来，医生们一直在试着用动物的器官来复原病人。这的确有很多优点，一是动物器官“取之不尽”；二是动物器官比起人类器官来，对人体更自然和更具生物性；三是异种器官可以“随要随取”，而人类器官即使有人提供，也有不便久存的难题。科学家采用血缘关系较近的物种如狒狒和黑猩猩，取得了最佳进展。狒狒的肝脏曾使人类存活到71天，而换了黑猩猩肾的人则活得长达9个月。然而，没有一种人类近亲显示出作为人类器官提供者的前途。狒狒的器官太小，不能长期支撑人体；黑猩猩太珍稀，又和人类血缘太近，不能按常规那样屠宰制成备用器官。而且任何灵长类动物都可能携带着致命的感染源。正如哈佛的微生物学家罗纳德·德斯罗西亚斯解释的“在进化尺度上与人类越近的物种，所携带新病原体之风险越大。”想想人类的爱滋病病毒最初便是在黑猩猩和猴子上发源的，既便是最热衷近亲移植的人现在也同意，我们应开发与人类有一定距离的“器官捐献者”了。
猪是人类临床异种器官移植的首选供体。首先，猪在体重和生理上与人类似。再者，猪的数量多，易于繁殖和饲养。还有它是非灵长类，不会像黑猩猩和狒狒那样引发较多伦理和安全性方面的关注。如今医生已在利用各种猪的配件，如心脏瓣膜、凝集团子、胰岛细胞，甚至大脑细胞来治疗人类的各类疾患。但异种器官移植将受到各种免疫机制的排斥，其中有超急性反应(HAR)、急性血管排斥和细胞排斥等。发生超急性排斥是由补体系统的免疫反应引起的，猪的内皮细胞具有糖类表面抗原Galal-3Galal-4GlcNAc-R(aGAL)，器官移植后，被人血清中预存的天然抗体(XNA)所识别，发生特异性结合，触发补体分子的活化，经各级补体反应，形成攻膜复合体(MAC)，针对异种组织发生细胞裂解作用，导致异种移植器官的炎症和血栓形成，使猪器官在十几分钟到几小时内就被排斥，即发生超急性排斥(HAR)。
补体系统由12种激活蛋白组成，分别构成两条分支激活途径和最终合一的作用途径，其中C3转化酶的激活是补体系列反应中最关键的一步。衰败加速因子(DAF)和膜辅助蛋白(MCP)是人类补体调节蛋白基因家族中的成员，它们和CRP家族中的其它成员(CR1、CR2、类CR1、类CR2等)一起呈簇状排列在人染色体1q32上。DAF可解离C3转化酶中的催化亚基，MCP间接地使结合亚基裂解和失活，从而抑制C3转化酶的装配。
应用转基因技术获得转基因猪，使供体表达人类补体调节蛋白DAF和MCP，这样供体器官能在C3/C5水平了阻断补体的级联反应，抑制或减弱人补体对猪器官的攻击，使异种移植的器官逃脱超急性排斥反应(HAR)。1995年，Kooyman、Diamond、Byrne分别实现了人CD59基因、MCP基因、DAF基因在小鼠中的表达，使小鼠的器官具有对人补体攻击的抗性。White等(1998)将10例hDAF转基因猪心脏移植到受免疫抑制的猕猴体内，异种心脏存活了3-62天。魏庆信等(1999)也获得表达hDAF的转基因猪，并进行猪—猴心脏移植，超急性排斥基本得到了控制。Yannoutsos(1996)利用YAC载体构建了表达hMCP的转基因小鼠模型，验证能显著阻止人血清引起的超急性排斥反应。白成等(1999)也证实表达hMCP的猪内皮细胞可抑制人血清补体的细胞毒作用。Daggett(1997)将3例hMCP转基因猪肺移植给狒狒，其存活时间延长至12小时。
但人类补体的级联反应是一种由多基因作用的，复杂的生理过程；在转基因猪中表达单个基因的调控蛋白，虽能明显减弱或抑制超急性排斥反应，但其效果不完全理想。据报道，MCP和DAF在功能上密切相关，且MCP+DAF的作用效果优于单个基因。因此，培育能表达几个或一组人补体调控蛋白的转基因猪就成为新的突破口。
本发明的目的在于在完成MCP和DAF基因克隆和测序基础上，把MCP和DAcDNA进一步连接成融合基因，相互间以富含Gly和Ser的10aa编码序列作柔性铰链连接，构建成国内首例具有起始、终止密码及正确阅读框架、长度为2120b的hMCP-DAF融合基因，为以后MCP和DAF融合基因的转基因动物的研究创造条件。
发明内容
本发明目的之一是提供两个基因的融合方法，该方法为在设计PCR引物时，将同一种限制性内切酶的酶切位点分别引入两个基因的连接区(即一个基因的PCR下游引物和另一个基因的PCR上游引物)，并添加一段柔性的连接肽序列(Linker)。然后分别通过PCR反应扩增两个基因，用相同的限制性内切酶酶切两个基因，再用DNA连接酶将两个基因融合。
本发明目的之二是提供融合两个基因的柔性连接肽的DNA序列，该序列长30bp，序列为GGC-GGT-GGT-GGG-TCT-GGT-GGT-GGC-GGC-TCG，连接肽DNA序列编码10个氨基酸，序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，由8个甘氨酸和2个丝氨酸组成。
本发明目的之三是提供新的融合基因hMCP-DAF的cDNA序列，全长为2120bp，编码区为11-2113bp。在融合基因中，1-955bp来自MCP基因(原MCP基因96～1050bp)，序列长为955bp；956-985bp为连接肽的DNA序列，共30bp；986-2120bp来自DAF基因(原DAF基因段的82～1216bp)，序列长为1135bp。
本发明目的之四是提供hMCP-DAF融合基因的氨基酸序列，融合基因MCP-DAF编码区为11-2113bp，具有起始、终止密码子及正确阅读框架，共编码700个氨基酸残基。其中，MCP段的编码序列是第11-955bp，编码315个氨基酸残基；连接肽位置在第956-985bp，编码10个氨基酸残基；DAF段的编码序列是第986-2114bp，编码375个氨基酸残基。
本发明目的之五是提供hMCP-DAF融合基因，其特征在于舍去了MCP的3’端跨膜疏水区，而保留MCP信号肽段；弃去了DAF的信号肽序列，而完整保留了DAF的GPI锚和跨膜疏水区；同时保留MCP和DAF各自的STP区。
本发明目的还提供了含MCP-DAF融合基因的重组载体、含重组载体的宿主细胞。
本发明的优点1)融合基因构建方法简单，只需通过PCR扩增目的基因、酶切PCR产物和连接酶连接就可完成。
2)在构建融合基因时，采用长30bp的连接肽DNA序列，它编码10个氨基酸，氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，由8个甘氨酸和2个丝氨酸组成，这有利于保持两个基因所编码的蛋白质保持各自原有的构象，不影响融合蛋白活性的发挥。
3)MCP和DAF在功能上密切相关，能在C3/C5水平了阻断补体的级联反应，抑制或减弱人补体对猪器官的攻击，使异种移植的器官逃脱超急性排斥反应。应用转基因技术使猪表达单个基因的调控蛋白，虽能明显减弱或抑制超急性排斥反应，但其效果不完全理想。hMCP-DAF融合基因作用效果优于单个基因，因此，它在异种器官移植中会发挥更好的作用。
4)在hMCP-DAF融合基因中，连接肽为10aa组成的柔性肽链，用甘氨酸和丝氨酸组成的柔性多肽连接MCP和DAF，有利于保持它们各自原有的蛋白质构象，不影响融合蛋白活性的发挥。
5)在hMCP-DAF融合基因中，舍去了MCP的3’端跨膜疏水区，保留MCP信号肽段，这有利于转hMCP-DAF基因的表达和及其蛋白的穿膜运输。
6)在hMCP-DAF融合基因中，弃去了DAF的信号肽序列，而完整保留了DAF的GPI锚和跨膜疏水区，这更有利于发挥DAF及在融合蛋白中的信号传导功能，使之能在细胞表面调控补体激活。
7)在hMCP-DAF融合基因中，保留MCP和DAF各自的STP区，使融合蛋白具有更多的糖基化位点，可使蛋白质在穿膜过程中不被水解。
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
具体实施例方式
1 PCR引物设计1.1在保留MCP和DAF基因的功能区域基础上，设计PCR引物，并将XhoI酶的位点分别引入两个基因的连接区，并添加一段柔性的连接肽序列(Linker)。1.2 MCP引物MCP上游引物与克隆MCP全长基因相同，引物(PM1)如下5′-TAG TGA ATT CGC GCC GCG C GA GCC TCC-3′EcoRI新设计的下游引物引入Xhol酶切位点，下游引物(PM2)共55mer，3′与模板配对20bp，Tm＝90.2℃，其中Gly4-Ser-Gly4-Ser为特定设计的连接肽序列，PM2序列如下Xho I5′-AG TCT CGA GCC ACC ACC AGA CCC ACC GCC CCA AAC ATC CAA ACT GTAA-3′1.3 DAF引物新设计的DAF上游引物(PD1)共26mer， 3′端与模板配对21bp，Tm＝78.6℃，序列如下
5′A GAC TCG AGC GTG CCC GCG GCG CTG C3′Xho IDAF下游引物(PD2)与克隆DAF全长基因相同，序列如下5′GCG AGT CTA GAT TCT TTG GCT AAG TCA3′XbaI2 PCR扩增2.1扩增MCP基因片段PCR反应体系MCP-pUC19重组质粒DNA 0.5-1.0μl，10xTaq butter 5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(PM113pmol/μl)1-2μl，下游引物(PM213pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1μ/μl)0.2-0.5μl，加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件为94℃变性1-2min，55℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。2.2扩增DAF基因片段PCR反应体系DAF-pUC19重组质粒DNA 0.5-1.0μl，10xTaq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(PD113pmol/μl)1-2μl，下游引物(PD213pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1μ/μl)0.2-0.5μl，加ddH2O至总体积50μl。
扩增条件为94℃变性1-2min，58℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸7-10min。2.3 MCP和DAF的PCR扩增结果MCP和DAF的PCR产物长约955和1135bp，。3扩增片段的回收用EcoRI/XhoI双酶切MCP和DAF的PCR的产物，用EcoRI/XbaI双酶切pUC19质粒，电泳回收酶切片段。4基因连接MCP、DAF扩增片段各500mg，pUC19的双酶切产物(40ng/μl)20μl，10×连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶(1U/μl)1μl，ddH2O 6μl，总体积10μl。16℃连接过夜将基因定向插入到质粒pUC19中。5连接产物克隆连接产物转化、感受态的制备、阳性克隆筛选、质粒DNA的提取均按文献进行。
MCP、DAF扩增片段与质粒pUC19连接并导入宿主菌DH5α后，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，筛选阳性重组质粒。1.9 DNA序列分析用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0测序试剂盒(Epicentre Teclnologies)对抽提的质粒在全自动测序仪(ABI Prim 377-18，PE公司)上进行测序，获得cDNA序列，全长共2120bp，详细序列见SEQ ID No.1，其中开放读框位于11-2113位核苷酸。在融合基因中，1-955bp来自MCP基因(原MCP基因95～1050bp)，序列长为955bp；956-985bp为连接肽的DNA序列，共30bp；986-2120来自DAF基因(原DAF基因段的82～1216bp)，序列长为1135bp。
根据得到的全长cDNA序列推导出融合基因MCP-DAF的氨基酸序列(开放读框位于11-2113位核苷酸)，具有起始、终止密码子及正确阅读框架，共编码700个氨基酸残基。其中，MCP段的编码序列是第11-955bp，编码315个氨基酸残基；连接肽位置在第956-985bp，编码10个氨基酸残基；DAF段的编码序列是第986-2114bp，编码375个氨基酸残基。其氨基酸序列详见SEQ ID No.2。
附本发明涉及的基因序列和蛋白质序列1.SEQ ID NO 1(MCP-DAF融合基因序列)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度2120碱基(B)类型核酸(C)链性双链(D)拓扑；线性(ii)分子型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.11CGCGCCGCGC GAGCCTC CCGGCCGCCG CGAGTGTCCC TTTCCTTCCT51 GGCGCTTTCC TGGGTTGCTT CTGGCGGCCA TGGTGTTGCT GCTGTACTCC101 TTCTCCGATG CCTGTGAGGA GCCACCAACA TCTGAAGCTA TGGAGCTCAC151 TGGTAAACCA AAACCCTACT ATGAGATTGG TGAACGAGTA GATTATAAGT201 GTAAAAAAGG ATACTTCTAT ATACCTCCTC TTGCCACCCA TACTATTTGT251 GATCGGAATC ATACATGGCT ACCTGTCTCA GATGACGCCT GTTATAGAGA301 AACATGTCCA TATATACGGG ATCCTTTAAA TGGCCAAGCA GTCCCTGCAA351 ATGGGACTTA CGAGTTTGGT TATCAGATGC ACTTTATTTG TAATGAGGGT401 TATTACTTAA TTGGTGAAGA AATTCTATAT TGTGAACTTA AAGGATCAGT451 AGCAATTTGG AGCGGTAAGC CCCCAATATG TGAAAAGGTT TTGTGTACAC501 CACCTCCAAA AATAAAAAAT GGAAAACACA CCTTTAGTGA AGTAGAAGTA551 TTTGAGTATC TTGATGCAGT AACTTATAGT TGTGATCCTG CACCTGGACC601 AGATCCATTT TCACTTATTG GAGAGAGCAC GATTTATTGT GGTGACAATT651 CAGTGTGGAG TCGTGCTGCT CCAGAGTGTA AAGTGGTCAA ATGTCGATTT701 CCAGTAGTCG AAAATGGAAA ACAGATATCA GGATTTGGAA AAAAATTTTA751 CTACAAAGCA ACAGTTATGT TTGAATGCGA TAAGGGTTTT TACCTCGATG801 GCAGCGACAC AATTGTCTGT GACAGTAACA GTACTTGGGA TCCCCCAGTT851 CCAAAGTGTC TTAAAGGTCC TAGGCCTACT TACAAGCCTC CAGTCTCAAA901 TTATCCAGGA TATCCTAAAC CTGAGGAAGG AATACTTGAC AGTTTGGATG951 TTTGGGGCGG TGGTGGGTCT GGTGGTGGCG GCTCGAGCGT GCCCGCGGCG1001 CTGCCCCTCC TCGGGGAGCT GCCCCGGCTG CTGCTGCTGG TGCTGTTGTG1051 CCTGCCGGCC GTGTGGGGTG ACTGTGGTCT TCCCCCAGAT GTACCTAATG1101 CCCAGCCAGC TTTGGAAGGC CGTACAAGTT TTCCCGAGGA TACTGTAATA1151 ACGTACAAAT GTGAAGAAAG CTTTGTGAAA ATTCCTGGCG AGAAGGACTC1201 AGTGGTCTGC CTTAAGGGCA GTCAATGGTC AGATATTGAA GAGTTCTGCA1251 ATCGTAGCTG CGAGGTGCCA ACAAGGCTAA ATTCTGCATC CCTCAAACAG1301 CCTTATATCA CTCAGAATTA TTTTCCAGTT CGTACTGTTG TGGAATATGA1351 GTGCCGTCCA GGTTACAGAA GAGAACCTTC TCTATCACCA AAACTAACTT1401 GCCTTCAGAA TTTAAAATGG TCCTCAGCAG TCGAATTTTG TAAAAAGAAA1451 TCATGCCCTA ATCCGGGAGA AATACGAAAT GGTCAGATTG ATGTACCAGG1501 TGGCATATTA TTTGGTGCAA CCATCTCCTT CTCATGTAAC ACAGGGTACA1551 AATTATTTGG CTCGACTTCT AGTTTTTGTC TTATTTCAGG CAGCTCTGTC1601 CAGTGGAGTG ACCCGTTGCC AGAGTGCAGA GAAATTTATT GTCCAGCACC1651 ACCACAAATT GACAATGGAA TAATTCAGGG GGAACGTGAC CATTATGGAT1701 ATAGACAGTC TGTAACGTAT GCATGTAATA AAGGATTCAC CATGATTGGA1751 GAGCACTCTA TTTATTGTAC TGTGAATAAT GATGAAGGAG AGTGGAGTGG1801 CCCACCACCT GAATGCAGAG GAAAATCTCT AACTTCCAAG GTCCCACCAA1851 CAGTTCAGAA ACCTACCACA GTAAATGTTC CAACTACAGA AGTCTCACCA1901 ACTTCTCAGA AAACCACCAC AAAAACCACC ACACCAAATG CTCAAGCAAC1951 ACGGAGTACA CCTGTTTCCA GGACAACCAA GCATTTTCAT GAAACAACCC2001 CAAATAAAGG AAGTGGAACC ACTTCAGGTA CTACCCGTCT TCTATCTGGG2051 CACACGTGTT TCACGTTGAC AGGTTTGCTT GGGACGCTAG TAACCATGGG2101 CTTGCTGACT TAGCCAAAGA2.SEQ ID NO 2(MCP-DAF融合基因编码的氨基酸序列)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度700个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构；线性(ii)分子型多肽(xi)序列描述SEQ IDNO.21 MEPPGRRECP FPSWRFPGLL LAAMVLLLYS FSDACEEPPT SEAMELTGKP51 KPYYEIGERV DYKCKKGYFY IPPLATHTIC DRNHTWLPVS DDACYRETCP101 YIRDPLNGQA VPANGTYEFG YQMHFICNEG YYLIGEEILY CELKGSVAIW151 SGKPPICEKV LCTPPPKIKN GKHTFSEVEV FEYLDAVTYS CDPAPGPDPF201 SLIGESTIYC GDNSVWSRAA PECKVVKCRF PVVENGKQIS GFGKKFYYKA251 TVMFECDKGF YLDGSDTIVC DSNSTWDPPV PKCLKGPRPT YKPPVSNYPG301 YPKPEEGILD SLDVW SVPAA LPLLGELPRL LLLVLLCLPA351 VWGDCGLPPD VPNAQPALEG RTSFPEDTVI TYKCEESFVK IPGEKDSVVC401 LKGSQWSDIE EFCNRSCEVP TRLNSASLKQ PYITQNYFPV RTVVEYECRP451 GYRREPSLSP KLTCLQNLKW SSAVEFCKKK SCPNPGEIRN GQIDVPGGIL501 FGATISFSCN TGYKLFGSTS SFCLISGSSV QWSDPLPECR EIYCPAPPQI551 DNGIIQGERD HYGYRQSVTY ACNKGFTMIG EHSIYCTVNN DEGEWSGPPP601 ECRGKSLTSK VPPTVQKPTT VNVPTTEVSP TSQKTTTKTT TPNAQATRST651 PVSRTTKHFH ETTPNKGSGT TSGTTRLLSG HTCFTLTGLL GTLVTMGLLT-
权利要求
1.一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的cDNA序列，其特征在于它包括编码具有hMCP-DAF融合基因多肽的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的cDNA序列，其特征在于所说的核苷酸序列编码具有SEQ.ID NO.2中的氨基酸序列的多肽及有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。
3.根据权利要求1所述的一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的cDNA序列，其特征在于所说的核苷酸序列具有SEQ.ID NO.1的多核苷酸序列及其任何形式的突变体，这些突变形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的cDNA序列，其特征在于所说的核苷酸序列中1-955bp来自MCP基因，序列长为955bp；956-985bp为连接肽的DNA序列，共30bp；986-2120bp来自DAF基因，序列长为1135bp。
5.根据权利要求1或2所述的一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的cDNA序列，其特征在于所说的核苷酸序列具有起始、终止密码子及正确阅读框架，共编码700个氨基酸残基，MCP段的编码序列是第11-955bp，编码315个氨基酸残基；连接肽位置在第956-985bp，编码10个氨基酸残基；DAF段的编码序列是第986-2114bp，编码375个氨基酸残基。
6.根据权利要求1或2所述的一种构建的人补体膜辅助调节蛋白和促衰变因子融合基因的cDNA序列，其特征在于所说的氨基酸序列舍去了MCP的3’端跨膜疏水区，而保留MCP信号肽段；弃去了DAF的信号肽序列，而完整保留了DAF的GPI锚和跨膜疏水区；同时保留MCP和DAF各自的STP区。
7.一种载体，其特征在于它含有权利要求1中之DNA。
8.一种宿主细胞，其特征在于它是用权利要求7所述载体转化的原核细胞或真核细胞。
9.一种融合基因的构建方法，其特征在于它在设计PCR引物时，将同一种限制性内切酶的酶切位点分别引入两个基因的连接区，即一个基因的PCR下游引物和另一个基因的PCR上游引物，并添加一段柔性的连接肽序列，然后分别通过PCR反应扩增两个基因，用相同的限制性内切酶酶切两个基因，再用DNA连接酶将两个基因融合。
10.根据权利要求9所述的一种融合基因的构建方法，其特征在于所说的用于构建融合基因的连接肽DNA长30bp，该序列设在连接区的PCR引物中，序列为GGC-GGT-GGT-GGG-TCT-GGT-GGT-GGC-GGC-TCG，连接肽DNA序列编码10个氨基酸，序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，连接肽由8个甘氨酸和2个丝氨酸组成。
全文摘要
本发明公开了一种融合基因及其编码的多肽和构建方法。它包括编码具有hMCP－DAF融合基因多肽的核苷酸序列，该融合基因在C3/C5水平阻断补体的级联反应，抑制或减弱人补体对猪器官的攻击，使异种移植的器官逃脱超急性排斥反应的作用效果优于单个基因，因此，它在异种器官移植中会发挥更好的作用。融合基因构建方法是在设计PCR引物时，将同一种限制性内切酶的酶切位点分别引入两个基因的连接区，并添加一段柔性的连接肽序列，然后分别通过PCR反应扩增两个基因，用相同的限制性内切酶酶切两个基因，再用DNA连接酶将两个基因融合。构建融合基因所用的连接肽DNA序列长30bp，编码的氨基酸序列由8个甘氨酸和2个丝氨酸组成，这有利于两个基因所编码的蛋白质保持各自原有的构象，不影响融合蛋白活性的发挥。
文档编号C12N15/12GK1390938SQ0213613
公开日2003年1月15日 申请日期2002年7月18日 优先权日2002年7月18日
发明者俞颂东, 乔守怡, 杨岐生, 崔秀璟, 李卫芬 申请人:浙江大学