专利名称：一种表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达载体及其应用，特别是涉及一种表达载体及利用该载体生产外源蛋白的方法。
背景技术：
目前，7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)是半合成头孢菌素的重要原料。7-ACA主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过酶法或传统的化学法裂解脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到。酶法具有工艺简单、安全、高效、无污染及产品质量稳定等优点，与传统的化学法相比具有较大的竞争优势，因而用酶法裂解头孢菌素C生产7-ACA以成趋势。用酶法裂解生产7-ACA，分为一步酶法和两步酶法(图1)一步酶法是利用头孢菌素C酰化酶(Cephalosporin C acylase)直接催化头孢菌素C，脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链，生成7-ACA，虽然该法步骤简单，但目前已知的CPC酰化酶的酶活较低，无法满足工业催化的需要；两步酶法是利用来源不同的两种酶进行两步催化反应，首先，头孢菌素C在D-氨基酸氧化酶(D-Amino Acid Oxidase，DAAO)的作用下，生成一个具有酮基的中间体，此中间体较不稳定，易被同时生成的H2O2氧化为戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)，然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链，生成7-ACA。
产生GL-7-ACA酰化酶的菌株大多为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，可把具有催化GL-7-ACA生成7-ACA活性的酶分为5类，同类酶的基因都具有95％以上的同源性，且酶学性质几乎完全相同。随着生物技术的发展，人们越来越重视用基因工程的方法来生产酶和改造酶。罗晖等(罗晖等，产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达，微生物学通报，2004，31(4)，38-42)使用了一种快速获取基因的方法，经过微生物选择性培养和特异性PCR扩增的方法从自然界中快速获取了GL-7-ACA酰化酶基因，并构建了基因工程菌BL21(DE3)/pET-Acy，实现了GL-7-ACA酰化酶的克隆与表达。
在用GL-7-ACA酰化酶催化GL-7-ACA生产7-ACA的研究中，人们通常是先对菌株进行培养和表达，然后进行酶的分离纯化和酶的固定化，最后将固定化酶与DAAO固定化酶混合起来一步催化CPC或分两步进行催化。长久以来，人们研究的重点都集中在提高酶的活力和稳定性上，而对酶的提取工艺和催化工艺进行改进的研究相对较少。
噬菌体分为温和噬菌体和烈性噬菌体。烈性噬菌体感染细胞后可立即在宿主细胞内开始自身的生命循环，引起细胞的裂解；温和噬菌体感染细胞后，细菌可不被裂解而继续生长繁殖，成为溶源性细菌。在溶源性细菌中，噬菌体的DNA被整合到细菌的染色体上，与细菌的染色体一起复制，且随细胞的分裂传给子代细胞，使其子代细胞也成为溶源性细胞。当需要细胞裂解时，可通过改变外界环境条件如紫外照射、提高环境温度或添加化学试剂等来诱导宿主细胞，使噬菌体的DNA从宿主细胞的染色体上脱落下来，并在细胞内独立复制，开始自身的生命循环，从而达到裂解宿主细胞的作用。
将噬菌体的DNA整合到E.coli的染色体上以获得溶源菌，利用溶源菌中的噬菌体来破细胞壁，使胞内积累的蛋白质释放的破壁方法具有破壁效率高、可控、操作条件温和等优点，具有潜在的应用价值。在研究感染了λ噬菌体的E.coli的裂解时发现，对细胞起裂解作用的主要是λ噬菌体DNA上裂解基因所编码的酶。λ噬菌体的裂解基因包括S、R和Rz三个基因，其中R基因的表达产物是一种可溶于水的转糖基酶(transglycosylase)，可分解细胞壁的肽聚糖。该酶与真正的溶菌酶的不同之处在于它可以引起肽键水解，而溶菌酶却只使肽聚糖上相邻的N-乙酰氨基葡萄糖残基间裂开。Rz基因表达产物可能是一种肽链内切酶(endopeptidase)，它可以切割肽聚糖的寡糖之间和/或肽聚糖与细胞壁外膜之间的交联。R和Rz基因表达产物的功能是降解细胞壁，而S基因表达产物的作用是改变细胞质膜的通透性，在细胞质膜上形成多孔的结构，以使R和Rz基因表达产物穿过细胞质膜到达细胞壁，从而作用于细胞壁。
当用含有琥珀突变缺陷型S基因的裂解基因S-RRz代替SRRz时，在诱导S-RRz表达后，细胞不被裂解而继续正常生长，并且可以在细胞内持续积累基因R和Rz表达产生的酶。但是，当在诱导表达后的细胞培养液中加入2％(v/v)CH3Cl，或将诱导表达后的细胞经冻融处理，则可以使细胞裂解。根据前面对S、R和Rz三个基因的表达产物在细胞裂解中不同作用的分析，认为此时细胞的裂解是依赖S基因的。加入CH3Cl和冻融处理的作用相当于S基因表达产物的功能，即破坏细胞质膜，让R和Rz产生的酶到达细胞的肽聚糖层。
发明内容
本发明的目的是提供一种可调控宿主细胞裂解的表达载体。
本发明所提供的表达载体是在启动子下游含有S-RRz基因的表达质粒。
所述S-RRz基因可具有序列表中序列2的核苷酸序列。
其中，用于构建所述表达载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒表达载体，如pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD等；优选为pET28a。
由本发明的表达载体构建的外源蛋白表达载体、细胞系及工程菌均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了利用该表达载体生产外源蛋白的方法。
本发明所提供的生产外源蛋白的方法，是先将外源基因插入上述表达载体得到外源基因表达载体，再将该外源基因表达载体导入宿主细胞，表达并裂解细胞得到外源蛋白。
所述外源蛋白优选为GL-7-ACA酰化酶。
其中，用于构建所述表达载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒表达载体，如pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD等；优选为pET28a。
所述GL-7-ACA酰化酶基因表达载体为pET-AS。
所述GL-7-ACA酰化酶基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
所述裂解细胞的方法可为下述三种方法中的任意一种1)用2mmol/L EDTA重悬细胞，在37℃裂解20-40min；2)用pH8.0，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液重悬细胞，在-30℃30min，37℃5min条件下进行一次冻融；3)用1mol/L NaOH溶液调节细胞悬液pH值至8-10，裂解20-40min。
被导入所述GL-7-ACA酰化酶基因表达载体的宿主细胞的发酵培养基和发酵条件与其相应的宿主细胞相同。
所述宿主可为大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌等，优选为大肠杆菌。所述大肠杆菌优选为E.coli BL21(DE3)。
本发明的表达载体用S-RRz代替SRRz，在利用该表达载体生产外源蛋白的过程中通过Tris-HCl、EDTA和NaOH处理模拟S基因的作用来改变细胞膜的通透性，使R和Rz基因产生的酶可以穿过细胞质膜到达细胞壁，裂解细胞壁，从而有望解决细胞培养时产品积累量最大与细胞裂解效率最高的矛盾。
本发明巧妙地构建了可调控宿主细胞壁裂解的表达载体，在生产过程中可实现宿主细胞的可控裂解破壁，即当目的蛋白(特别是GL-7-ACA酰化酶)大量积累后采用生物方法破壁，既可简化外源蛋白的分离纯化步骤，又可减少化学试剂的使用量。
图1为酶法制备7-ACA的过程示意2为重组质粒pET-AS的物理图谱图3为E.coli BL21(DE3)/pET-AS诱导表达后的全菌SDS-PAGE电泳图谱
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用酶如无特别说明均为TaKaRa公司产品。
实施例1、含有GL-7-ACA酰化酶基因和λ噬菌体裂解酶S-RRz基因的重组表达载体pET-AS的构建1、含有GL-7-ACA酰化酶基因的重组载体pET-Acy的构建按照文献(罗晖等，产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达，微生物学通报，2004，31(4)，38-42)的方法构建含有GL-7-ACA酰化酶基因的重组载体pET-Acy。
2、含有λ噬菌体裂解酶S-RRz基因的重组载体pUC18-S-RRz的构建按照清华大学博士论文尹进，基因工程大肠杆菌中聚-β-羟基丁酸酯的分离提取，(1998.4)的方法构建含有λ噬菌体裂解酶S-RRz基因的重组载体pUC18-S-RRz。
3、重组表达载体pET-AS的构建1)以步骤1的含有GL-7-ACA酰化酶基因的重组质粒pET-Acy为模板，在引物15’-TATGCGTACATATGGAGCCGACCTCGACGC-3’(划线部分碱基为Nde I识别位点)和引物25’-TAGGAATTCTCATGGCTTGAAGTTG-3’(划线部分碱基为EcoR I识别位点)的引导下进行PCR，扩增得到带有Nde I和EcoR I酶切位点的GL-7-ACA酰化酶基因。PCR的反应体系为10μL的10×PCR缓冲液，0.3μL dNTP(10mM，赛百盛公司)，1μL引物1(终浓度50pmol)，1μL引物2(终浓度50pmol)，0.5μL质粒pET-Acy溶液(浓度为50ng/μL)，0.2μL pfu DNA聚合酶(5U/μL，北京奇华盛生物技术发展中心)，用无菌水补足至总体积20μL。PCR反应条件为94℃1分钟；94℃1分钟，56℃1.5分钟，72℃2.5分钟，30个循环；72℃10分钟。
2)将步骤1)获得的带有Nde I和EcoR I酶切位点的GL-7-ACA酰化酶基因用Nde I和EcoR I限制性内切酶进行酶切，并与用同样酶酶切的大肠杆菌表达质粒pET28a(Novagen公司)用T4DNA连接酶连接。将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌TOP-10F’感受态细胞(Invitrogen公司)，用含有100μg/mL卡那霉素的LB抗性平板37℃培养16hr进行筛选，挑取单菌落接种于液体LB培养基中37℃培养12-24小时，离心收集菌体并用碱裂解法提取质粒，用EcoR I限制性内切酶进行酶切后用0.7％琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到7.4kbp的条带，表明得到了含有GL-7-ACA酰化酶基因的重组质粒，将其命名为pET-AcyII。
3)将步骤2的重组质粒pUC18-S-RRz用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行酶切，将酶切产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳后回收得到电泳纯的λ噬菌体裂解酶基因S-RRz片段，将其与同样酶酶切的质粒pET-AcyII用T4DNA连接酶进行连接，将连接产物用CaCl2法转化大肠杆菌TOP-10F’感受态细胞，在含有100μg/mL卡那霉素的LB抗性平板37℃培养16hr进行筛选，挑取单菌落接种于液体LB培养基中37℃培养12-24小时，离心收集菌体并用碱裂解法提取质粒，用EcoR I限制性内切酶进行酶切后用0.7％琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到9.0kbp的条带，表明得到了含有GL-7-ACA酰化酶基因和λ噬菌体裂解酶S-RRz基因的重组质粒pET-AS，其物理图谱如图2所示。
实施例2、GL-7-ACA酰化酶的表达1)将实施例1的重组质粒pET-AS用CaCl2法转化宿主细胞E.coli BL21(DE3)(Promega公司)，利用引物1和引物2进行菌落PCR筛选得到含有GL-7-ACA酰化酶基因和λ噬菌体裂解酶S-RRz基因的基因工程菌，将其命名为E.coli BL21(DE3)/pET-AS；2)将E.coli BL21(DE3)/pET-AS接种于LB液体培养基中(LB培养基的配方为酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH 7.0)，37℃摇床培养12-24小时。取菌液按5％的比例转接于含卡那霉素50μg/mL的50mL LB液体培养基中，37℃继续培养2小时，再加入1mmol/L的IPTG或乳糖25-37℃诱导培养10-24小时，使OD600＝3，离心收集菌体。将收集的菌体进行全菌SDS-PAGE电泳，结果如图3所示(泳道1为Marker，泳道2-3为全菌蛋白)，在18kD和58kD处有两条明显的蛋白条带，其中18kD蛋白条带对应GL-7-ACA酰化酶的α亚基，58kD的蛋白条带对应GL-7-ACA酰化酶的β亚基，表明GL-7-ACA酰化酶的α亚基和β亚基加工正确，该基因工程菌表达的GL-7-ACA酰化酶蛋白正确。测得的GL-7-ACA酰化酶的酶活为150U/L。
实施例3、用λ噬菌体裂解酶S-RRz裂解细胞可用以下三种方法中的任一方法裂解实施例2中经离心收集的菌体细胞a)用0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬菌体细胞，在-30℃30min，37℃5min条件下进行一次冻融，测定菌悬液OD600值；b)用2mmol/L EDTA重悬菌体细胞，37℃空气浴摇床振摇(60rpm)30min后，测定菌悬液OD600值；c)用1mol/L NaOH溶液调节溶液pH值至8-10，裂解30min测定菌悬液OD600值。并以用去离子水重悬等量的菌体细胞，37℃空气浴摇床振摇(60rpm)30min后的菌悬液OD600值为对照。结果表明与对照相比，2mmol/L EDTA裂解样品的OD600值下降27％，0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液冻融样品的OD600值下降33.3％，1mol/L NaOH溶液裂解样品的OD600值下降15.1％，表明上述方法模拟S基因的作用改变了细胞膜的通透性，使R和Rz基因产生的酶可以穿过细胞质膜到达细胞壁，裂解细胞壁。
实施例4、将经λ噬菌体裂解酶S-RRz裂解的细胞固定化用于GL-7-ACA催化生产7-ACA
1)用λ噬菌体裂解酶S-RRz裂解细胞将E.coli BL21(DE3)/pET-AS接种于LB液体培养基中(LB培养基的配方为酵母粉0.5％、胰蛋白胨1％、NaCl 1％，pH 7.0)，37℃摇床培养12-24小时。取菌液按5％的比例转接于含卡那霉素50μg/mL的50mL LB液体培养基中，37℃继续培养2小时，再加入0.01-2mmol/L的IPTG或乳糖25-37℃诱导培养10-24小时，使OD600＝3，离心收集菌体。用0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液重悬菌体细胞，在-30℃30min，37℃5min条件下进行一次冻融，得到菌体裂解液。
2)称500mg的丙烯酰胺和40mgBis(N-N’亚甲基双丙烯酰胺)混均后，用2ml水溶解，迅速加入到步骤1)的菌体裂解液中，再加入0.5ml 5％TEMED(四甲基己二胺)和0.5ml 2.5％过硫酸铵，迅速搅匀后冰浴3-5分钟，得到10％的聚丙烯酰胺凝胶，再用水冲洗凝胶后，将凝胶切成0.1cm3大小，用蒸馏水洗净，抽干，与用0.1mol/LTris-HCl(pH8.0)缓冲液溶解的50ml浓度为0.5g/L的GL-7-ACA溶液混合，28℃摇床振荡(60rpm)60min。采用C18柱(SHIMADZU公司)的HPLC法检测反应产物，流动相为7.5％乙腈-15％甲醇-1％乙酸，流速为1mL/min。检测结果表明，60min内GL-7-ACA基本转化为7-ACA，7-ACA的生成率约为90％。
序列表<160>2<210>1<211>2163<212>DNA<213>假单胞菌(Pseudomonas sp.)<400>1atgctgagag ttctgcaccg ggcgacgtcc gccctggtta tggcgactgt gatcggcctt 60gcgcccggcg tcgcctttgc gctggccgag ccgacctcga cgccgcaggc gccgattgcg 120gcctataaac cgagaagcaa tgagatcctg tgggacggct acggcgtccc gcacatctac 180ggggtcgacg cgccccccgc cttctacggc tacggctggg cccaggcgcg aagccacggc 240gacaatatcc tgcgcctgta tggagaagcg cggggcaagg gggccgaata ctggggcccg 300gattacgaac agacgaccgt ctggctgctg accaacggcg tgccggagcg cgcccagcag 360tggtatgcgc agcagtcgct ggatttccgc gccaacctcg acgccttcgc ggcgggcatc 420aacgcctatg ccgaacagaa cccagacgac atctcgcccg aggtgcggca ggtgctgccg 480gtttccggcg ccgacgtggt ggcgcacgcc catcgcctga tgaacttcct ctatgtcgcg 540tcgcccggcc gcaccctggg cgagggcgat ccgccggacc tggccgatca ggggtccaac 600tcctgggccg tggcgccggg caagacggcg aacgggaacg ccctgctgct gcggaacccg 660cacctgtcct ggacgacgga ctacttcacc tactacgagg cgcatctcgt cacgccggac 720ttcgaagtct atggcgcgac ccagatcggc ctgccggtca tccgcttcgc cttcaatcag 780cggatgggca tcaccaatac cgtcaacggc atggtggggg ccaccaacta tcggctgacg 840cttcaggacg gcggctatct gtacgacggt caggtgcggc cgttcgagcg gcgtcaggcc 900tcgtatcgcc tgcgtcaggc ggacgggtcg acggtcgaca agccgttgga gattcgctcc 960agcgtccatg gcccggtctt cgagcgcgcg gacggcacgg ccgtcgccgt tcgggtcgcc1020ggtttggatc ggccgggcat gctcgagcag tatttcgaca tgatcacggc cgacagcttc1080gacgactacg aagccgccat ggcgcggatg caggtgccga ccttcaacat cgtctgcgcc1140gaccgcgaag ggaccatcaa ctacagcttc aacggcgtgg cgccccaacg ggccgagggc1200gacatcgcct tctggcaggg gctcgtgcct ggcgattcct cgcgttacct gtggaccgag1260
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权利要求
1.一种表达载体，是在启动子下游含有S-RRz基因的表达质粒。
2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述S-RRz基因具有序列表中序列2的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于用于构建所述表达载体的出发载体为pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD。
4.由权利要求1所述的表达载体构建的外源蛋白表达载体、细胞系及工程菌。
5.利用权利要求1-3任一项权利要求所述的表达载体生产外源蛋白的方法，是先将外源基因插入所述表达载体得到外源基因表达载体，再将该外源基因表达载体导入宿主细胞，表达并裂解细胞得到外源蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述外源蛋白为GL-7-ACA酰化酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于用于构建所述表达载体的出发载体为pET28a、pET28b、pET28c、pET32、pMAL、pKK或pBAD；优选为pET28a。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述GL-7-ACA酰化酶基因表达载体为pET-AS。
9.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于所述裂解细胞的方法为下述三种方法中的任意一种1)用2mmol/L EDTA重悬细胞，在37℃裂解20-40min；2)用pH8.0，0.1mol/L Tris-HCl缓冲液重悬细胞，在-30℃、30min，37℃、5min条件下进行一次冻融；3)用1mol/L NaOH溶液调节细胞悬液pH值至8-10，裂解20-40min。
10.根据权利要求5-8任一所述的方法，其特征在于所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌；优选为大肠杆菌；更优选为E.coli BL21(DE3)。
全文摘要
本发明公开了一种表达载体及其应用。其目的是提供一种可调控宿主细胞裂解的表达载体及利用该载体生产外源蛋白的方法。所述表达载体是在启动子下游含有S RRz基因的表达质粒。利用该表达载体生产外源蛋白的方法，是先将外源基因插入上述表达载体得到外源基因表达载体，再将该外源基因表达载体导入宿主细胞，表达裂解细胞得到外源蛋白。本发明巧妙地构建了可调控宿主细胞壁裂解的表达载体，在生产过程中可实现宿主细胞的可控裂解破壁，即当目的蛋白(特别是GL－7－ACA酰化酶)大量积累后采用生物方法破壁，既可简化外源蛋白的分离纯化步骤，又可减少化学试剂的使用量。
文档编号C12P21/02GK1760365SQ20041008362
公开日2006年4月19日 申请日期2004年10月13日 优先权日2004年10月13日
发明者周航, 于慧敏, 罗晖, 沈忠耀 申请人:清华大学