专利名称：一种筛选cd18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及筛选优良种牛的方法及其专用引物，特别是涉及一种利用牛CD18基因的单核苷酸多态性筛选CD18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物。
背景技术：
牛白细胞黏附缺陷症(bovine leukocyte adhesion deficiency，BLAD)是一种常染色体上由单基因控制的隐性遗传疾病，是由编码嗜中性粒细胞表面糖蛋白的CD18基因的一个点突变引起的(Shuster，D.E.，Bosworth，B.T.，Kehrli，M.E.Jr.Sequenceof the bovine CD18-encoding cDNAcomparison with the human and murineglycoproteins.Gene.1992，114(2)267-271.)。CD18基因已经被定位在1号染色体上。Shuster等对1头患BLAD的荷斯坦牛的CD18基因进行了序列分析，结果发现，自5’端第383位碱基由A突变为G，该突变是错义突变，导致128位的天门冬氨酸突变为甘氨酸(D128G)，致使白细胞表面的β2整合素表达明显减少或缺乏而引起临床发病。BLAD临床主要表现为严重的重复性感染、脓液形成减弱、伤口愈合延迟和白细胞增多，也表现在犊牛初生重低和发育不良(Muller KE，Bernadina WE，Kalsbeek HC，et al.Bovine leukocyte adhesion deficiency--clinical course andlaboratory findings in eight affected animals.Vet Q.1994，16(2)65-71；Gerardi AS.Bovine leucocyte adhesion deficiencya review of a modern diseaseand its implications.Res Vet Sci.1996，61(3)183-186.)。BLAD的生理基础是白细胞粘附及相关功能(包括吞噬和趋化作用)的缺陷。BLAD多发生于1-14月龄的荷斯坦奶牛，当隐性突变基因CD18纯合时奶牛表现为发病，当隐性突变基因杂合时奶牛表现为正常，但该牛是BLAD的携带者。Janosa等研究发现，BLAD还对奶牛的产奶量产生负面影响(Janosa A，Baranyai B，Dohy J.Comparison of milk productionof the progeny of BLAD-carrier and healthy Holstein bull s in Hungary.ActaVet Hung.1999；47(3)283-289)。
目前，BLAD遗传缺陷的发现已经引起了世界各国奶牛育种协会和育种工作者的重视，在美国、日本、丹麦和荷兰等国家相继报道了在荷斯坦牛群中存在BLAD有害基因(Olchowy TW，Bochsler PN，Nei lsen NR，et at.Bovine leukocyte adhesiondeficiencyin vitro assessment of neutrophil function and leukocyteintegrin expression.Can J Vet Res.1994，58(2)127-33；Bernadina WE，DuitsAJ，Kalsbeek HC，et at.Leukocyte adhesion deficiency in a Dutch Holsteincalfa case with a clear-cut family history.Vet Immunol Immunopathol.1993，37(3-4)295-308.)。随后美国、加拿大和欧洲一些国家大量的基因检测和系谱分析发现，世界非常著名的公牛通常携带该隐性突变基因，如Hawkeye bull(CANM369995)就是BLAD的携带者。一头优秀种公牛一生可以生产几十万剂甚至上百万剂的冷冻精液，由于冷冻精液和人工授精技术的普及和广泛应用，优秀种公牛的遗传影响是显而易见的。由此可见，荷斯坦牛群中发现的BLAD遗传缺陷带来的是世界性问题，这导致近年来奶牛育种工作者在重视优秀种公牛生产性能表现的同时，更加重视优秀种公牛是否携带隐性有害基因。
通过基因检测和分子选育技术，可以在分子水平上解决奶牛的遗传改良问题。一方面，通过基因检测技术可以发现种公牛或种子母牛携带隐性有害基因的情况，并加以选择剔除，避免了通过人工授精技术传播遗传缺陷基因的风险；另一方面，通过遗传标记基因或候选基因可以对数量性状基因(QTL)进行定位分析，从而实现对后备种公牛的早期选择，可以缩短奶牛世代间隔，加快遗传改良的速度。欧美等奶业发达国家已将分子选育技术应用于小公牛的选育和淘汰中。据有关专家预测，随着奶牛和其它主要家畜品种质量和数量性状基因图谱的完成及分子选育技术的渗入，整个育种体系将发生革命性改变。
近几年，在美国、加拿大和日本等国家相应建立了种公牛遗传缺陷基因的分子检测方法和育种方案，并在种公牛系谱上明确标注了隐性基因的携带情况，从而可合理的指导种公牛的选种选配，有效地降低了隐性有害基因CVM的不良影响。目前，BLAD有害基因的分子检测方法主要是PCR-RFLP法(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)(Mukhopadhyaya PN，Mehta HH，RathodRN.A method for the simulation of normal，carrier and affected controls forPCR-RFLP screening of a genetic disease in dairy cattle.Mol Cell Probes.2000，14(6)381-384；Norouzy A，Nassiry MR，Eftekhari Shahrody F.Identificationof bovine leucocyte adhesion deficiency(BLAD)carriers in Holstein and BrownSwiss AI bulls in Iran.Genetika.2005.41(12)1697-1701.)，但是，PCR-RFLP法要求建立阳性对照才能保证检测结果的准确性，而且成本较高，不适合规模化检测。因此，迫切需要一种准确、快速、经济的BLAD有害基因的分子检测方法。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)及等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等。具体采用哪一种方法，需要结合靶序列的特点和实验条件来确定。
日本Orita等研究发现，单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同，因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。将SSCP用于检测PCR扩增产物的基因突变而建立的PCR-SSCP技术，进一步提高了基因突变检测方法的便捷性和灵敏性。
PCR-SSCP技术(Orita M，Iwahana H，Kanazawa H.Detection of polymorphismsof human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformationalpolymorphisms.Proc Natl Acad Sci.1989，862766-2770.；Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.A rapid and sensitive detetion of point mutation and geneticpolymorphism using polymerase chain reaction.Genomics.1989，5874-879.)是检测DNA突变最为直观而精确的实验技术手段之一，该方法对长度在100-300bp之间的DNA片段突变检测的灵敏度可达100％，结合序列分析，可做到对大批量样品的目的DNA片段的“全扫描”分析，不仅成本低，而且自动化程度较高，因此，在进行基因诊断和多态性分析，包括单核苷酸多态(SNP)的检测中，PCR-SSCP技术不失为一种准确、快速、简便、经济的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用牛CD18基因的单核苷酸多态性筛选CD18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物。
本发明所提供的用于筛选CD18基因正常的优良种牛的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。
将由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对命名为BLF/BLR，序列表中的序列1由20个碱基组成，序列表中的序列2由21个碱基组成。
本发明的第二个目的是提供一种筛选CD18基因正常的优良种牛的方法。
本发明所提供的筛选优良种牛的方法，是以待测牛的基因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第32位碱基为A、G还是N，扩增片段自5’端第32位碱基为A的种牛为CD18基因正常的优良种牛；所述N为A和G的杂合体。
所述待测牛的基因组DNA的来源是广泛的，可以从血液(新鲜或冷冻)、精液(新鲜或冷冻)、组织样品(如耳组织等)或含有毛囊的牛毛样品中提取。
如果PCR扩增片段自5’端第32位碱基为A，即CD18基因第二外显子自5’端第55位碱基为A时，其纯合体的基因型命名为AA；如果PCR扩增片段自5’端第32位碱基为G，即CD18基因第二外显子自5’端第55位碱基为G时，其纯合体的基因型命名为BB；它们的杂合体基因型命名为AB。
基因型为AA的牛为CD18基因正常的优良种牛；基因型为BB的牛为BLAD患者，根据牛的表型就能辨别，不需要专门设备和技术来检测；基因型为AB的牛为携带隐性有害突变CD18基因的牛，即BLAD携带者。
其中，以25μl总体积为例，PCR扩增的反应体系包括模板DNA 40ng，Taq酶1.5U，20pmol/L上、下游引物各0.5μl，2.5mmol/L dNTPs 2μl，10×PCR缓冲液2.5μl，用重蒸水补充反应体系至25μl。10×PCR缓冲液的组成是Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM。PCR反应条件为先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；最后72℃延伸7min。
所述检测扩增产物的方法可为对扩增产物进行14％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后银染显色。具体方法可为取1.5μl扩增产物，加入6μl上样缓冲液(98％甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，10％甘油，0.025％溴酚蓝和0.025二甲苯青)，98℃变性10min后，立即放入冰水混合物中冷却，点样，用14％非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，银染显色。结果发现存在2种不同基因型AA型和AB型，基因分型结果如附图4所示。经测序发现，AA基因型牛的CD18基因第2外显子(exon2)第55位碱基为A，该基因型属正常牛只，在国际上统一采用“TL”标识；而AB基因型牛的CD18基因第2外显子第55位碱基为N，该基因型的牛是BLAD携带者，在国际上统一采用“BL”标识。
本发明提供了一种筛选CD18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物。该方法利用CD18基因第二个外显子自5’端第55位碱基的多态性，并根据基因型对种牛进行筛选，剔除不利等位基因。本发明的筛选方法操作简单，快捷，费用低廉，准确度高(可达99％)，并可实现自动化的直接检测。此外，可根据本方明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于筛选携带有利等位基因(AA)的个体，为种牛的育种工作提供便利。本发明将在BLAD有害基因的检测及优良种牛的分子选育中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
图1为特异性引物BLF/BLR在CD18基因中的位置示意2为特异性引物BLF/BLR的PCR扩增片段的大小及BLAD突变位点示意3为退火温度为64℃的PCR扩增产物的2.0％琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为牛CD18基因的PCR-SSCP分析检测图，其中AA型为正常牛，AB型为BLAD携带者图5为不同基因型的测序峰图具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、用于筛选CD18基因正常的优良种牛的引物设计及PGR反应条件的优化一、引物设计依据牛CD18基因的核苷酸序列(GenBank号Y12672)，用Oligo6.0软件设计用于PCR-SSCP筛选CD18基因正常的优良种牛的特异性PCR引物，PCR产物长度为150-300bp左右比较适合PCR-SSCP检测。通过对一系列PCR引物的设计、筛选和优化，最终根据如序列表中序列3所示的核苷酸序列，该序列中包含引起BLAD的突变位点(第32位碱基，即A55GCD18基因Exon2自5’端第55位碱基，正常牛为碱基A，BLAD牛为碱基G)，设计出引物BLF(上游引物)5’-ACCTTCCGGAGGGCCAAGGG-3’(序列表中序列1)和引物BLR(下游引物)5’-AGTAGCTGCCTCACCAATGCG-3’ (序列表中序列2)，特异性PCR引物BLF和BLR在CD18基因中的位置示意图见图1，其扩增片段的大小及BLAD突变位点示意图如图2所示，将该引物对命名为BLF/BLR。
二、PCR反应条件优化选择北京市种公牛站的荷斯坦公牛为实验材料，提取新鲜血液的基因组DNA(基因组DNA可以从冷冻血液、精液(新鲜或冷冻)、组织样品(如耳组织等)或含有毛囊的牛毛样品中提取)并以此为模板，在引物对BLF/BLR的引导下利用梯度PCR仪进行PCR扩增，25μl PCR反应体系为dNTP混合物(4×2.5mol/L)2μl，10×PCR缓冲液(Tris·HCl(pH8.3)100mM，KCl 500mM，MgCl215mM)2.5μl，正、反向引物(20pmol/L)各0.5μl，Taq DNA聚合酶(3U/μl)0.5μl，模板DNA(20ng/μl)2μl，ddH2O 17μl；PCR反应条件初步设定为94℃预变性5min；94℃变性30s，55±10℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。反应结束后，对不同退火温度的PCR扩增产物各取3ul进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，其中退火温度为64℃的PCR扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示(泳道1-8PCR扩增产物，泳道M100bp ladder Marker)，PCR扩增产物长度为162bp，与预期结果一致，且扩增条带单一，浓度较高，可用于PCR-SSCP检测，因此，将优化的PCR反应条件定为94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。
实施例2、PCR-SSCP筛选CD18基因正常的优良种牛及其测序鉴定一、PCR-SSCP筛选提取54头种公牛新鲜血液的基因组DNA并以此为模板，在实施例1获得的特异性引物对BLF/BLR的引导下进行PCR扩增，PCR反应体系与实施例1相同，反应条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；72℃延伸7min。反应结束后，54头种公牛的PCR扩增产物各取1.5μl置于PCR管中，分别加6μl上样缓冲液(98％甲酰胺，10mM EDTA pH8.0，10％甘油，0.025％溴酚蓝和0.025二甲苯青)，98℃变性10min后，立即置于冰上冰浴5min，点样，进行14％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(120V，16-18h)，其中14％非变性聚丙烯酰胺凝胶(30mL体积，0.1cm胶条)的制作方法为清洗玻璃板，烘干，用0.8％琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙；配制30mL 14％的聚丙稀酰胺胶工作液(30％聚丙烯酰胺12.0mL，50％甘油3mL，10×TBE 3mL，10％过硫酸铵200μl，TEMED 12μl，纯水12mL)，混合后迅速灌胶；当浇灌至离玻璃板上沿0.1cm时停止灌胶，插入梳子，室温聚合约半小时，多余的聚丙烯酰胺4℃保存，并随时观察凝胶聚合情况，补加聚丙烯酰胺；凝胶聚合后，向电泳槽中加入1×TBE，为了保证电泳条带的整齐性，用注射器冲洗加样孔，预电泳20min后，可上样。电泳结束后，采用硝酸银染色方法进行染色，具体方法包括以下步骤1)小心取下凝胶，置于70％乙醇中，放在水平摇床上缓慢摇动15min(乙醇用完可以回收)进行固定；2)去离子水洗凝胶2遍，每次2-3min，尽量除去乙醇；3)用200mL染色液(NH3·H2O 2mL，3.6％NaOH 4.2mL，20％AgNO33.6mL，加去离子水至200mL)染色30min；4)去离子水洗凝胶3遍，每次2-3min，尽量洗去多余的染色液；5)用200mL显色液(1％柠檬酸钠1mL，甲醛100ul，加去离子水至200mL)显色约10-30min，当单链DNA条带的清晰度合适时，倒掉显色液；6)用去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相。
基因分型结果如图4所示，发现存在2种不同基因型，AA为纯合基因型，表示正常牛只，采用“TL”标识；AB为杂合基因型，表示BLAD携带者，采用“BL”标识。在所检测的54头种公牛中，AA基因型53头，AB基因型仅有1头，也就是说仅有1头公牛是BLAD突变基因携带者。
二、测序鉴定用测序的方法对步骤一的检测结果进行鉴定，具体方法为采用Geneclean试剂盒(购自北京天为时代科技有限公司)回收并纯化步骤一中以54头种公牛新鲜血液为模板的PCR-SSCP扩增产物，使用ABI PRISM377 DNA测序仪，通过Dye primer试剂盒(购自美国PE公司)对纯化的PCR扩增产物直接进行正、反方向测序，进一步验证步骤一的基因分型检测结果。测序结果表明，AA基因型公牛PCR扩增片段的核苷酸序列如序列表中序列3所示，第32位碱基为A，即CD18基因第2外显子自5’端第55位碱基为A；AB基因型公牛PCR扩增片段的核苷酸序列中第32位碱基为N，即CD18基因第2外显子自5’端第55位碱基为N(N表明的是未检出的碱基，实际上在样品中该位点存在两种情况即A和G，测序结果显示为N，本发明亦以N来表示在该位点的碱基，即N表示A和G杂合)。两种基因型的部分基因测序峰图见图5。CD18基因第二外显子A55G错义突变即为引起BLAD的碱基突变，上述测序结果证明步骤一的基因分型结果正确，本发明的方法及其专用引物可用于筛选CD18基因正常的优良种牛，据统计，检测准确率达99％以上。
序列表<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1accttccgga gggccaaggg20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2agtagctgcc tcaccaatgc g21<210>3<211>162<212>DNA<213>牛(Bos taurus)
<400>3accttccgga gggccaaggg ctaccccatc gacctgtact acctgatgga cctctcctac 60tccatggtgg atgacctcgt caacgtcaag aagctggggg gtgacctgct ccgggccctc 120aatggcatca ccgagtcggg ccgcattggt gaggcagcta ct16权利要求
1.用于筛选CD18基因正常的优良种牛的引物，是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。
2.一种筛选CD18基因正常的优良种牛的方法，是以待测牛的基因组DNA为模板，在权利要求1所述的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第32位碱基为A、G还是N，扩增片段自5’端第32位碱基为A的种牛为CD18基因正常的优良种牛；所述N为A和G的杂合体。
3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于所述PCR反应体系为模板DNA40ng，Taq酶1.5U，20pmol/L上、下游引物各0.5μl，2.5mmol/LdNTPs 2μl，10×PCR缓冲液2.5μl，用重蒸水补充反应体系至25μl。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反应条件为先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，共进行35个循环；最后72℃延伸7min。
全文摘要
本发明公开了一种筛选CD18基因正常的优良种牛的方法及其专用引物。该引物是由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对。该方法是以待测牛的基因组DNA为模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列组成的引物对的引导下进行PCR扩增，检测扩增片段自5’端第32位碱基为A、G还是N，扩增片段自5’端第32位碱基为A的种牛为CD18基因正常的优良种牛；所述N为A和G的杂合体。本发明的筛选方法操作简单，快捷，费用低廉，准确度高(可达99％)，并可实现自动化的直接检测。此外，可根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于筛选携带有利等位基因(AA)的个体，为种牛的育种工作提供便利。
文档编号C12N15/11GK1970793SQ200610144259
公开日2007年5月30日 申请日期2006年11月30日 优先权日2006年11月30日
发明者李艳华, 张胜利, 韩广文, 薛建华, 朱玉林, 刘振君 申请人:北京奶牛中心