专利名称：检测鼻咽癌放射敏感性基因的方法及其引物与荧光探针的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，先通过逆转录(RT)mRNA样品得到cDNA，再利用实时荧光定量PCR技术，精确定量被检测样本中基因表达量。
背景技术：
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)好发于中国南方各省及东南亚地区，其病因涉及EB病毒、遗传因素(遗传易感性)、多种癌基因和抑癌基因的相互作用以及环境和饮食因素。近年来随着分子生物学及其技术的飞速发展，人们通过对癌基因和抑癌基因的深入研究，认识到癌变是一个涉及多重基因事件的复杂过程。鼻咽癌发生、发展及其生物学行为的研究也已进入基因水平，关于鼻咽癌癌基因和抑癌基因的研究方兴未艾。鼻咽癌有很多分化类型，常见于咽隐窝，位于咽鼓管咽口内侧角的后内侧壁。鼻咽癌发病年龄大多在40 60岁之间，男性多于女性。世界大部分地区鼻咽癌发病率较低，一般在1/105以下。 鼻咽癌的发病有明显的地区聚集性和种族性现象，多见于黄种人，患者主要集中在广东、潮汕和福州方言人群以及这些人群移民到海外者。我国南方(广东、广西、福建和湖南等省) 和东南亚一些国家是全世界鼻咽癌发病率最高的地区，特别是广东中西部的肇庆、佛山和广州地区更高。肇庆四会的男性NPC发病率为25. 12/105，女性为12. 11/105 ；居住在广东省中部以及讲广东地方语的男性发病率高达30/105 50/105。流行病调查指出鼻咽癌的病因可能与下列因素有关①EB病毒感染。②环境与饮食环境因素也是诱发鼻咽癌的一种原因。在广东，调查发现癌高发区的大米和水中的微量元素镍含量较低发区为高。在鼻咽癌患者的头发中，镍含量亦高。动物试验表明，镍能促进亚硝胺诱发鼻咽癌。也有报道食用咸鱼及腌制食物是中国南方鼻咽癌高危因素，且与食咸鱼的年龄，使用的期限、额度及烹调方法有关。③遗传因素鼻咽癌病人有种族及家族聚集现象，如居住在其他国家的中国南方人后代仍保持着很高的鼻咽癌发病率，这提示鼻咽癌可能是遗传性疾病。由于鼻咽的解剖部位深在，解剖结构复杂，病理主要为非角化型未分化癌以及易出现颈部淋巴结及远处转移，在初诊的患者中，III、IV期鼻咽癌约占总病例的70%左右。 放射治疗在过去很长一段时间都是鼻咽癌的标准治疗手段，但单纯放射治疗鼻咽癌的5年生存率仅50%左右，而晚期鼻咽癌(III、IV)的5年生存率更低，约10% 40%，治疗失败的主要原因是局部复发和远处转移。因此，研究如何改善鼻咽癌患者的治疗效果变得非常必要和有意义。因鼻咽癌是对化疗相对敏感的肿瘤，因此寻找有效的耐受性好的化疗药物以及放化疗的结合方式是近年来的研究热点。此外，随着分子生物学的发展，已发现一些生物学指标能预测恶性肿瘤的预后及疗效，在风险评估及制定治疗策略时发挥重要作用。研究表明ZNF187，CLSTNl，HBG2，PROO149，NME6, SMARCC1, GL009, GLO10，GLOl 这 9 个基因在鼻咽癌放射敏感型患者和鼻咽癌放射抗拒型患者中的表达有显著差异，通过检测这9个基因的表达情况可以为鼻咽癌的治疗提供指导。传统的基因诊断技术主要运用聚合酶链反应(PCR)或逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法大量扩增待测基因，然后通过溴化乙锭染色和琼脂糖凝胶电泳定量待测基因。以上方法有着极高的高灵敏度，但基于PCR反应的特点，反应终点的产物量往往无法正确反映反应初始阶段DNA的含量，因此定量不够精确，同时其检测的分辨率也不高，DNA的量的差异如果低于五倍，往往检测不出。近年来不断完善的实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入了荧光基团，利用荧光信号的积累监控整个PCR的进程，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA精确定量。由于只对指数期反应的产物进行检测和荧光基团的信号放大作用，它克服了传统PCR的定量不精确，分辨率低的缺点。
发明内容
本发明的目的是提供针对鼻咽癌放射敏感性基因定性、定量检测的引物。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测ZNF187基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2组成的引物对。用于检测CLSTm基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO :3和SEQ ID N0:4组成的引物对。用于检测HBG2基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6组成的引物对。用于检测PR00149基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8组成的引物对。用于检测NME6基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10组成的引物对。用于检测SMARCC1基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO 11和SEQ ID NO 12组成的引物对。用于检测GL009基因的引物，是由序列表中SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14组成的引物对。用于检测GL010基因的引物，是由序列表中SEQ ID N0:15和SEQ ID N0:16组成的引物对。用于检测GLOll基因的引物，是由序列表中SEQ ID N0:17和SEQ ID N0:18组成的引物对。本发明还提供了针对鼻咽癌放射敏感性基因进行定量检测的荧光探针。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案用于检测ZNF187基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID N0:19和SEQ IDNO 20 的DNA序列。用于检测CLSTm基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID NO 21和SEQ IDNO 22 的DNA序列。用于检测HBG2基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24的 DNA序列。用于检测PR00149基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID N0:25和SEQ IDNO 26 的DNA序列。
用于检测NME6基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID N0:27和SEQ ID NO :28的 DNA序列。用于检测SMARCC1基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID NO :29和SEQ IDNO 30 的DNA序列。用于检测GL009基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID NO 31和SEQ ID NO 32 的DNA序列。用于检测GL010基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID NO 33和SEQ ID NO 34 的DNA序列。用于检测GLOll基因的荧光探针，是由序列表中SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36 的DNA序列。所述探针经过荧光标记，5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭集团。报告荧光基团为FAM或VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。本发明还提供了一种检测鼻咽癌放射敏感性基因的试剂盒，可包括上述引物以及荧光探针。
具体实施例方式ZNF187基因表达的定量检测1.样本总RNA的抽提和质检收集病例样本20例，根据鼻咽部照射60Gy时CT检查结果，肿瘤消退< 40%为放射抗拒，> 80%的为放射敏感作为放射敏感性的评价指标，分为放射敏感组与放射抵抗组。 20例除一例分类不明之外，敏感组8例，抵抗组11例。病例样本在鼻咽纤维镜直视下活检，将活检组织转移到用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。将碾磨成粉末状的样品，转移至预先加入适量TRIzoI试剂的勻浆管中，把勻浆管置于冰浴中，在组织勻浆粉碎机上进行勻浆。勻浆至勻浆液不粘且无颗粒即可。注放入勻浆管前用电子天平称重并记录，根据重量按1 2的比例加入TRIzol试剂，一般小于Ig的组织加入5或IOml裂解液。将勻菜转移至15ml离心管中，于_4°C，12000rpm，离心lOmin。小心吸取上清液移入新的15ml离心管，在15 30°C放置5min。向勻浆中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力振荡离心管，在15 30°C放置:3min。注氯仿与勻浆液的比例是1 5。于-4°C，12000rpm，离心15min。从离心机中小心取出离心管，吸取上清至另一个15ml离心管。注吸取上清时一定要小心，动作要轻，不能使中间的蛋白成分漂浮上来，否则直接影响到RNA的质量。加入异丙醇，轻轻颠倒离心管以充分混勻液体，在15 30°C放置lOmin。注加异丙醇的量为等体积的上清液。于_4°C，12000rpm,离心lOmin。弃去上清，缓慢的沿管壁加入75%乙醇1ml，用枪头反复摧打，使白色的附壁的物质全部融解，并移入1. 5ml离心管中。在涡旋器上短暂涡旋，于_4°C，8000rpm,离心lOmin。小心弃上清，短暂离心，移液枪吸取所有上清(即75%乙醇)，在超静工作台中干燥沉淀5min。
加入Rnase-free的Milli-Q水完全RNA融解沉淀后，_80°C保存。加入40-50U的 Milli-Q 水。紫外分光光度计测定总RNA的纯度取IyL溶液溶于99μ L Tris中，并用紫外线分光光度计检测0D260, 0D280, 0D320, 0D230的吸收值。注=Ratio值即0D260/ 0D280≥1. 800为质检合格。总RNA热稳定实验取0. 5ml Eppendorf管中分别加入RNA 400ng，取两管70°C处理1小时，另一管-20°C处理1小时，同时进行1. 5% Rnase-free的琼脂糖电泳，观察RNA 的质量。注在70°C和-20°C两个实验中显示RNA条带清楚，边界不模糊，提示RNA没有发生降解，质检为合格。2.逆转录 PCR(1)在500 μ 1微量离心管中，加入总RNA 1-5 μ g，补充适量的DEPC H20使总体积达Ι μ 。在管中加10 μ M Oligo (dT) 12-18 1 μ 1，轻轻混勻、离心。(2) 70°C加热lOmin，立即将微量离心管插入冰浴中至少lmin。然后加入下列试剂的混合物IOXPCR buffer2μ 125mM MgC122μ 1IOmM dNTPmix1 μ 10. IM DTT2 μ 1轻轻混勻，离心。42°C孵育2_5min。(3)加入 Superscript II 1 μ 1，在 42°C水浴中孵育 50min。(4)于70°C加热15min以终止反应。(5)将管插入冰中，加入RNase H 1 μ 1，37°C孵育20min，降解残留的RNA。_20°C 保存备用。3.扩增检测在7900荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为25 μ 1，其中12. 5 μ 1 PCR反应混合物，2. 5 μ 1检测用引物、荧光探针，5 μ 1待测样品cDNA。反应条件95°C 10分钟变性，随后进行95°C 15秒，60°C—分钟45个循环，最后置于4°C。根据标准曲线，计算各待测样品中ZNF187基因的拷贝数。4.结果
" 放射敏感组拷贝数(平均放射抗拒组拷贝数(平均
值).· ‘值)
ZNFl871.7 XIO4/μ 13. 5 X107 μ i序列表<160>64<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列 <220> <230> <400>1
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CN 102168129 A
说明书5/10页<212>DNA
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<230>
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权利要求
1.用于检测ZNF187基因的引物，是由序列表中SEQID NO :1和SEQ ID NO :2组成的引物对。
2.用于检测CLSTm基因的引物，是由序列表中SEQID NO 3和SEQ ID NO 4组成的引物对。
3.用于检测HBG2基因的引物，是由序列表中SEQID NO 5和SEQ ID NO 6组成的引物对。
4.用于检测PR00149基因的引物，是由序列表中SEQID NO :7和SEQ ID N0:8组成的引物对。
5.用于检测NME6基因的引物，是由序列表中SEQID NO :9和SEQ ID N0:10组成的引物对。
6.用于检测SMARCC1基因的引物，是由序列表中SEQID N0:11和SEQ ID N0:12组成的引物对。
7.用于检测GL009基因的引物，是由序列表中SEQID N0:13和SEQ ID N0:14组成的引物对。
8.用于检测GL010基因的引物，是由序列表中SEQID N0:15和SEQ ID N0:16组成的引物对。
9.用于检测GLOll基因的引物，是由序列表中SEQID N0:17和SEQ ID N0:18组成的引物对。
10.用于检测ZNF187基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 19的DNA序列。
11.用于检测CLSTm基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 20的DNA序列。
12.用于检测HBG2基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO :21的DNA序列。
13.用于检测PR00149基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 22的DNA序列。
14.用于检测NME6基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 23的DNA序列。
15.用于检测SMARCC1基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 24的DNA序列。
16.用于检测GL009基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 25的DNA序列。
17.用于检测GL010基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO 26的DNA序列。
18.用于检测GLOll基因的荧光探针，是序列表中SEQID NO :27的DNA序列。
19.根据权利要求10-18所述的DNA序列，其特征在于5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭集团。
20.根据权利要求10-18所述的荧光探针，其特征在于所述报告荧光基团为FAM或 VIC，不发光的淬灭基团为NFQ。
21.一种检测鼻咽癌放射敏感性基因的试剂盒，包括权利要求1-9所述的引物以及权利要求10-18所述的荧光探针。
全文摘要
本发明公开了用于检测鼻咽癌放射敏感性基因的方法及其引物与荧光探针。用于检测鼻咽癌放射敏感性基因的引物，是由序列表中SEQ ID1～SEQ ID18共18条DNA序列组成。荧光探针是序列表中SEQ ID19～SEQ ID27共9条DNA序列所述DNA序列5’端标记有发光颜色不同的报告荧光基团，3’端标记有不发光的淬灭基团。本发明为鼻咽癌放射敏感性的检测提供了新的途径，对于鼻咽癌的治疗有指导作用。
文档编号C12N15/11GK102168129SQ20101011453
公开日2011年8月31日 申请日期2010年2月26日 优先权日2010年2月26日
发明者李瑶, 楼屹, 裘敏燕, 郭懿, 陈甲信 申请人:上海博星基因芯片有限责任公司, 广西壮族自治区人民医院