专利名称：用于培养哺乳动物细胞的生物反应器的制作方法
用于培养哺乳动物细胞的生物反应器本发明涉及生物反应器以及使用这些生物反应器大规模培养哺乳动物细胞的方法。在哺乳动物细胞培养工艺中重要的是维持溶解氧、培养pH、温度和剪切敏感性方面的物理化学环境。营养环境的维持也是重要的。培养条件的维持限制了进行大规模哺乳动物细胞培养的可能性。特别是浓度梯度能够抑制在大规模生物反应器中哺乳动物细胞的细胞生长。本发明的目的之一是提供允许大规模体积培养哺乳动物细胞的生物反应器和方法。此外，本发明的目的是提供生物反应器和方法，即使大规模体积生长，其也允许在最佳条件下培养哺乳动物细胞，并由此允许与生物反应器的尺寸无关的工艺性能和产量。本发明的目的是提供大规模生物反应器，其允许在诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境下培养哺乳动物细胞，在所述生物反应器中保持良好的细胞悬浮和使营养补料(feed)混合。此外，本发明的目的是提供设备和方法，所述设备和方法允许以大规模的方式生产哺乳动物细胞和哺乳动物细胞产物，尤其是由哺乳动物细胞合成的蛋白、肽、抗体或氨基酸。通过提供如权利要求书中所述的用于培养真核细胞、特别是哺乳动物细胞的生物反应器、生物反应器系统和方法，本发明解决了构成本发明的基础的技术问题。尤其是通过提供用于培养哺乳动物细胞的生物反应器，本发明解决构成本发明基础的技术问题，所述生物反应器特征在于其具有至少两个叶轮。此外，通过提供用于培养和增殖哺乳动物细胞的方法，本发明解决了构成本发明基础的技术问题，所述方法特征在于在具有至少两个叶轮的生物反应器中，在合适的条件下和合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞。此外，通过提供用于培养哺乳动物细胞的生物反应器系统，本发明解决了构成本发明基础的技术问题，所述生物反应器系统特征在于具有至少500升体积的a)第一生物反应器与体积大于所述第一生物反应器并具有至少2000升体积的b)第二生物反应器连接，并且其中所述具有至少2000升体积的第二生物反应器与体积大于所述第二生物反应器体积并具有至少两个叶轮和至少10000升体积的c)第三生物反应器连接。此外，通过提供培养和增殖哺乳动物细胞的方法，本发明解决了构成本发明基础的技术问题，所述方法特征在于a)在具有至少500升体积的第一生物反应器中，在合适的条件下和合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞，b)将通过增殖至少一个哺乳动物细胞获得的含细胞培养基转移入具有至少2000升体积的第二生物反应器，c)在所述具有至少2000升体积的第二生物反应器中培养被转移的细胞，d)将在步骤c)中获得的含细胞培养基转移入具有至少10000升体积的第三生物反应器以及e)在所述具有至少10000升体积的第三生物反应器中培养所述被转移的细胞。根据本发明，培养细胞为真核细胞，优选动物细胞，更优选哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞可以为例如人类细胞系、小鼠骨髓瘤(NOS)细胞系，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系或杂交瘤细胞系。优选的哺乳动物细胞为中华仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
培养细胞优选用于生产抗体，更优选单克隆抗体，和/或重组蛋白，更优选用于治疗应用的重组蛋白。所述细胞当然可以生产肽、氨基酸、脂肪酸或其它有用的生化中间体或代谢产物。根据本发明，通过培养细胞生产的蛋白的目标浓度为大于0.5g/l，优选大于 2.0g/l，最优选大于10.0g/l。能够以分批或补料分批的方式使用本发明的方法。虽然在本发明的方法中使用的细胞培养基优选为无蛋白培养基，但该设计不排除使用含蛋白流体 (stream)0根据本发明，生物反应器为具有附加设备的生物相容性罐或容器，所述附加设备例如叶轮、挡板、分布器(sparger)和/或孔(port)，其尤其允许用于培养和增殖哺乳动物细胞。优选所述罐或容器为管道的形式，在管道的两末端(其优选构建罐的顶和底)具有平板。这些平板被称为顶板和基板。在本发明的一种特别优选实施方案中，基板为American Society of Mechanical Engineers Flanged and Dished (ASME F&D，美国机械工程师协会 F&D)设计的基板。所述顶板设计优选符合人孔或优选装凸缘的顶板以允许安装/拆卸叶轮。总罐高为从罐的底部的罐内侧至罐的顶部的罐内侧的切线。将自由空间(freeboard，净空)高度定义为当将生物反应器填充至其操作体积时，在液体顶部之上直线侧的长度。最小自由空间高度必需考虑在操作过程中形成泡沫的程度、在允许的最大搅拌和通气下气体容纳以及液体测量误差。本发明的生物反应器具有的体积为优选至少500升，更优选至少1000升，更优选至少4000升，甚至更优选至少10000升，甚至更优选至少20000升。最优选地，本发明的生物反应器具有的体积为1000升、1307升、4000升、5398升、20000升或27934升。优选，生物反应器具有最大体积100000升，更优选，生物反应器具有最大体积 50000升，最优选生物反应器具有最大体积30000升。本发明的生物反应器的设计保证在所述生物反应器中诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境，保持良好混合细胞悬浮和使营养补料混合。这为最佳的细胞生长、产物积累和产物质量提供了必要的物理化学环境。本发明的生物反应器的设计进一步保证了维持几何相似性。这允许在12升实验室规模和500升中试规模开发按比例缩小的模型。本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器具有至少两个叶轮。更优选，所述生物反应器具有两个叶轮，甚至更优选顶部叶轮(top impeller)和底部叶轮(bottom impeller)。本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮优选水翼式叶轮(hydrofoil impeller)。本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮为水翼式叶轮。本发明的用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少1000升的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮为水翼式叶轮。本发明用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少4000升的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮优选水翼式叶轮。本发明用于培养哺乳动物细胞的生物反应器优选具有至少4000升的体积以及至少一个顶部叶轮和至少一个底部叶轮，其中顶部叶轮为水翼式叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮为水翼式叶轮。优选可使用顶部叶轮以提供强的主体混合。在本发明一种优选的实施方案中，底部叶轮为水翼式叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮和底部叶轮为水翼式叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，至少顶部叶轮为水翼式叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，所有叶轮都为水翼式叶轮。根据本发明的一种优选实施方案，底部叶轮为大稠度斜叶式叶轮(high-solidity pitch-blade impeller)或大稠度水翼式叶轮。优选可使用底部叶轮以分散分布的 (sparged)气体。优选地，水翼式叶轮提供大得多的液体运动，对于给定量的功率输入导致更大的主体混合。这也可依赖于流量数(flow number, Nq)。优选地，非水翼式叶轮能够提供液体运动，但是在更大的功率输入下提供。这对于剪切敏感性哺乳动物细胞的健康具有重要性。在本发明一种优选的实施方案中，水翼式叶轮为向下流动叶轮或向上流动叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮为向下流动叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，顶部叶轮为向下流动轴向水翼式叶轮。在本发明一种优选的实施方案中，使用顶部叶轮下推特性来混合充分充气的液体表面和液体主体。在本发明的一种优选实施方案中，水翼式叶轮为高效水翼式叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，水翼式叶轮为Chemineer-SC-3型叶轮、LIGHTNIN-A310或A510型叶轮、 I^romix-PHF 型系列叶轮或 Cleaveland Eastern Mixers 叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，顶部叶轮为高效水翼式叶轮。在本发明的一种优选实施方案中，顶部叶轮为Chemineer-SC-3型叶轮、LIGHTNIN-A310或A510型叶轮、 I^romix-PHF 型系列叶轮或 Cleaveland Eastern Mixers 叶轮。顶部叶轮优选三叶水翼式设计的叶轮，例如来自LIGHTNIN的A310型叶轮。底部叶轮优选四斜叶大稠度叶轮，例如来自LIGHTNIN的A315型叶轮。顶部叶轮(Dw/T)和/ 或底部叶轮(DlilZt)的叶轮与罐直径之比优选0.35以上至0.55以下，更优选0.40以上至 0. 48以下，最优选0. 44以上至0. 46以下。大于0. 5的直径导致破坏轴向流动，由此导致差的搅拌和充气。顶部叶轮功率数(power number, Np)优选0. 1以上至0. 9以下，更优选0. 25以上至0. 35以下，最优选0. 3。顶部叶轮流量数(N,)优选0. 4以上至0. 9以下，更优选0. 50以上至0. 60以下，最优选0. 56。底部叶轮功率数(Np)优选0.5以上至0.9以下，更优选0. 70 以上至0.80以下，最优选0.75。底部叶轮流量数(N,)优选0.50以上至0. 85以下，更优选 0. 70以上至0. 80以下，最优选0. 73。叶轮功率数(Np)为将旋转叶轮叶片的动能传递至流体的叶轮效率的度量。量化气体分散是重要的。叶轮流量数(N,)为叶轮泵送能力的度量标准且在量化流体主体运动方面是重要的。所述至少两个叶轮的搅拌速率由规模决定。然而，在本发明一种特别优选的实施方案中，所述至少两个叶轮的搅拌速率为200转/分钟(rpm)以下，更优选165rpm以下。叶轮间距(Ds)为所述至少两个叶轮间的距离。在本发明一种特别优选的实施方案中，其为IX底部叶轮的直径(D底)以上至2XD底以下，更优选其为1.2^XD底或2XD底。 这将允许两叶轮在最小接种后体积下均保持浸没。在本发明一种特别优选的实施方案中，上叶轮(upper impeller)以上的液体高度(D0)为0.3X顶部叶轮的直径(D顶)以上至2.5XD顶以下。更优选其为0. 5XD顶以上至 2. 0XDw。底部间隙(D。)为罐底部与底部叶轮中心线间的间隙。在本发明一种特别优选的实施方案中，其为0. 35XD底以上，更优选其为0. 4XD底或0. 75XD底。在本发明的生物反应器中，叶轮的设计在主体混合、气体分散和低剪切力方面提供了最佳的流体动力学特性。通过经由本发明的叶轮系统的搅拌，将哺乳动物细胞保持在勻相悬浮液中。在本发明的生物反应器中，叶轮的设计提供了快速混合、保持勻相、保持哺乳动物细胞悬浮和气泡分散。在本发明的生物反应器中，叶轮的设计使由剪切力造成的细胞损伤最小化，所述剪切力源自叶轮几何结构以及在叶轮叶片后面产生的漩涡或涡流。在本发明一种特别优选的实施方案中，所述至少两个叶轮为顶部驱动搅拌系统。优选通过至少一个分布器释放来供应空气，尤其是压缩空气，或特定气体，优选氧气、氮气和/或C02。本发明的生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选所述生物反应器具有一个分布器或两个分布器。本发明的生物反应器优选具有两个分布器。优选所述生物反应器具有至少一个管几何结构分布器。优选至少一个分布器为槽式(flute-type)或为烧结的分布器。优选至少一个分布器为槽式。在本发明特别优选的实施方案中，采用了新月形管道。 新月形的曲率优选为0.8XD&为了有助于从生物反应器的侧孔安装和移出，所述新月形圆周优选0.8XD底圈的完整圆周的。至少一个分布器提供充分的氧传质(通过体积传质系数(Kp)来表征)以满足培养物的氧需求。所述至少一个分布器提供I^a高达2( -1,用于培养具有每小时5mmol/l氧摄取速率的多达每毫升20X IO6个细胞的培养物。用作双分布器系统的两个分布器允许去除溶解的CO2和控制溶氧张力(DOT)。槽式分布器提供了容易就地清洗(CIP)和就地消毒 (SIP)、帮助d(X)2去除并由于其多种用途而减少操作成本的益处。烧结分布器提供较高的 K^值。槽式分布器设计的较低固有I^a值能够通过使用富氧空气得到补偿。气体流动速度在恒定表观气速的基础上按比例增加。在哺乳动物细胞的大规模培养中，重要的是保持在溶解氧、培养pH和温度、以及溶解CO2、营养物和代谢物浓度梯度方面的均相物理化学环境。在通过使用适当搅拌和充气而确保物理化学环境为均相的同时，重要的是确保所选的搅拌和充气操作条件不产生不利的剪切环境。本发明涉及在确保均相环境和同时使剪切环境的不利影响最小化之间的适当平衡，所述均相环境将促进良好的细胞生长和哺乳动物细胞培养工艺的产率。这将通过限定以下来实现特定生物反应器几何结构、叶轮设计和定位、分布器设计和定位以及特定的用于搅拌和充气速率的操作限制。在搅动和分布的生物反应器中对哺乳动物细胞的主要损害来自界面剪切。当分布气泡合并和破裂时发生界面剪切[参考文献Ma N,Koelling Kff,Chalmers JJ. Biotechnol Bioeng. 2002 Nov 20 ；80 (4) :428-37.勘误于Biotechnol Bioeng. 2003 Feb 5 ；81 (3) 379]。因此，期望使分布气体的流动和泡沫的过度产生最小化。界面剪切能够通过合并以下方法而最小化首先，通过借助液体表面和液体主体的良好混合来促进表面充气，其次， 通过借助优选两个分布器来分开进行培养物的充氧。水翼式叶轮的指定位置，尤其是上叶轮以上的液体高度( )，优选为液体表面下约0. 5XDW，这能够帮助强且连续的液体表面和液体主体的交换，从而使充分充氧的液体表面和不充分充氧的液体主体混合。规定的叶轮间距优选为Ds= 1乂0/!|至2乂0；!|，这能够允许由上叶轮产生的液体的向下流动去补充流入下叶轮(lower impeller)的液体，由此保证整个流动主体良好混合且不产生单独的混合区域。规定的叶轮底部间隙优选为D。= 0. 35XD至0. 75XD，这能确保主体流动能够偏离弯曲的ASME F&D基底并沿着生物反应器的壁上升。流经控制分布器的“按需”充氧分布气体从流经镇流分布器(ballast sparger)的非充氧分布气体(如CO2、空气和氮气镇流(ballast))的分离，能够允许在流体中的高度充氧的分布气泡在从流体主体中分离并进入顶部空间之前更长的驻留时间和路径长度。对于给定容积的传质系数ky这能够允许提供更大的氧传输速率。分布气泡的驻留时间和路径长度还可以通过限定向下流动轴向水翼式叶轮来进一步延长，所述向下流动轴向水翼式叶轮连续向下推动液体表面和液体主体。本发明的生物反应器优选具有至少一个挡板，更优选具有至少两个挡板。本发明的生物反应器最优选具有四个挡板。挡板为垂直辐射状设置的板。挡板用于防止形成漏斗或形成涡旋。在本发明一种优选的实施方案中，所述至少一个挡板的长度为1. IX生物反应器的总直线高度。挡板宽度(W)优选为0. IX罐内部直径(T)。挡板间隙(Wc)优选为0. OlX 罐内部直径(T)。所述至少一个挡板的高度(Heft)优选为1. IX总直线高度(H)-生物反应器顶部高度(Hh)。因此，Heft优选根据式Heft= 1. IXH-Hh来计算。不限定所述至少一个挡板的厚度，但该厚度应确保对流体流的径向分量的刚性。 需要额外的厚度以确保在SIP期间挡板不被变形从而影响挡板至罐壁的间隙。本发明的生物反应器优选具有至少两个用于添加碱的孔。更优选，所述生物反应器具有两个用于添加碱的孔。最优选，生物反应器具有两个用于添加碱的孔，其中第一个孔位于底部叶轮的中线，第二个孔位于顶部叶轮的中线。优选，PH探头(probe)与碱添加孔在直径方向相对地位于生物反应器中。在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器具有1000升的体积。1000升的生物反应器的顶部体积(Vh)优选45升以上至65升以下，更优选顶部体积为55升。1000升的生物反应器的基部体积(Vb)优选45升以上至65升以下，更优选基部体积为55升。本发明的1000升生物反应器的罐内部直径(T)优选850mm以上至900mm以下，更优选罐内部直径为864mm。本发明的1000升生物反应器的罐横截面面积(A)优选0. 55m2以上至0. 65m2以下，更优选罐横截面面积为0. 586m2。本发明的1000升生物反应器的顶部高度(Hh)(其为顶板的高度)，和/或基部高度(Hb)(其为基板的高度)优选为120mm以上至180mm以下， 更优选顶部高度和/或基部高度为151mm。本发明的1000升生物反应器的总罐高度优选
82000mm以上至^OOmm以下，更优选总罐高度为2347mm。本发明的1000升生物反应器的顶部叶轮直径(Dw)和/或底部叶轮直径(D底)优选350mm以上至400mm以下，更优选顶部叶轮直径和/或底部叶轮直径为381mm。本发明的1000升生物反应器的罐底部与底部叶轮中线的间隙(D。)优选120mm以上至180mm以下，更优选该间隙为152mm。本发明的1000升生物反应器的所述至少两个叶轮间的距离(也称为叶轮间距(Ds)优选730mm以上至790mm以下，更优选该叶轮间距为762mm。本发明的1000升生物反应器的叶轮轴直径优选为102mm 以上至152mm以下。如果本发明的1000升生物反应器具有挡板，则挡板的长度优选2000mm 以上至MOOmm以下，更优选该长度为2250mm。本发明的1000升生物反应器的挡板宽度优选70mm以上至IOOmm以下，更优选该宽度为86mm。本发明的1000升生物反应器的挡板间隙优选7mm以上至Ilmm以下，更优选该挡板间隙为9mm。本发明的1000升生物反应器的挡板高度(Heft)优选2000mm以上至2200mm以下，更优选该挡板高度为2099mm。本发明的 1000升生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选其具有一个分布器。本发明的1000升生物反应器的至少一个分布器优选具有1. 5mm以上至2. 5mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为2mm。喷嘴数或孔数优选为20以上至40以下，更优选该喷嘴数或孔数为 30。分布器长度(SL)优选为150mm以上至550mm以下，更优选该分布器长度为305mm。本发明的1000升生物反应器的分布器至罐底的间隙(Sc)优选50mm以上至75mm以下，更优选分布器至罐底的间隙为64mm。本发明的1000升生物反应器的分布器至底部叶轮的间隙 (Dc-Sc)优选75mm以上至IOOmm以下，更优选分布器至底部叶轮的间隙为88mm。
在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器具有体积4000升。4000升的生物反应器的顶部体积(Vh)优选340升以上至370升以下，更优选顶部体积为359升。4000升的生物反应器的基部体积(Vb)优选340升以上至370升以下，更优选基部体积为359升。 本发明的4000升生物反应器的罐内部直径(T)优选1600mm以上至1650mm以下，更优选罐内部直径为16沈讓。本发明的4000升生物反应器的罐横截面面积(A)优选1. 90m2以上至2. 30m2以下，更优选罐横截面面积为2. 076m2。本发明的4000升生物反应器的顶部高度 (Hh)和/或基部高度(Hb)优选260mm以上至300mm以下，更优选该顶部高度和/或基部高度为观2讓。本发明的4000升生物反应器的总罐高度优选2300mm以上至3100mm以下，更优选总罐高度为观17讓。本发明的4000升生物反应器的顶部叶轮直径(Dw)和/或底部叶轮直径(Dlil)优选680mm以上至740mm以下，更优选顶部叶轮直径和/或底部叶轮直径为710mm。本发明的4000升生物反应器的罐底部与底部叶轮中线的间隙(D。)优选500mm 以上至560mm以下，更优选该间隙为531mm。本发明的4000升生物反应器的所述至少两个叶轮间的距离(也称为叶轮间距(Ds)优选840mm以上至900mm以下，更优选该叶轮间距为 872mm。本发明的4000升生物反应器的叶轮轴直径优选为51mm以上至64mm以下。如果本发明的4000升生物反应器具有挡板，则该挡板的长度优选为2200mm以上至^OOmm以下， 更优选该长度为M77mm。本发明的4000升生物反应器的挡板宽度优选150mm以上至180mm 以下，更优选该宽度为163mm。本发明的4000升生物反应器的挡板间隙优选12mm以上至 20mm以下，更优选该挡板间隙为16mm。本发明的4000升生物反应器的挡板高度(Heft)优选2100mm以上至2300mm以下，更优选该挡板高度为2195mm。本发明的4000升生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选其具有一个分布器。本发明的4000升生物反应器的至少一个分布器优选具有1. 5mm以上至2. 5mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为2mm。本发明的4000升生物反应器的喷嘴数或孔数优选为80以上至120以下，更优选该喷嘴数或孔数为100。分布器长度(SL)优选为250mm以上至800mm以下，更优选该分布器长度为568mm。本发明的4000升生物反应器的分布器至罐底部的间隙(Sc)优选315mm以上至360mm以下，更优选分布器至罐底部的间隙为337mm。本发明的1000升生物反应器的分布器至底部叶轮的间隙(D。-S。)优选180mm以上至205mm以下，更优选分布器至底部叶轮的间隙为194mm。 在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器具有20000升的体积。20000升的生物反应器的顶部体积(Vh)优选1600升以上至2000升以下，更优选顶部体积为1803升。 20000升的生物反应器的基部体积(Vb)优选1600升以上至2000升以下，更优选基部体积为1803升。本发明的20000升生物反应器的罐内部直径(T)优选2500mm以上至3000mm 以下，更优选罐内部直径为2794mm。本发明的20000升生物反应器的罐横截面面积(A)优选5. Sm2以上至6. 5m2以下，更优选罐横截面面积为6. 131m2。本发明的20000升生物反应器的顶部高度(Hh)和/或基部高度(Hb)优选460mm以上至500mm以下，更优选该顶部高度和/或基部高度为485mm。本发明的20000升生物反应器的总罐高度优选4800mm以上至 5100mm以下，更优选总罐高度为4933mm。本发明的20000升生物反应器的顶部叶轮直径(D 顶)禾P /或底部叶轮直径(D底)优选IlOOmm以上至1300mm以下，更优选顶部叶轮直径和/ 或底部叶轮直径为1219mm。本发明的20000升生物反应器的罐底部与底部叶轮中线的间隙 (Dc)优选890mm以上至945mm以下，更优选该间隙为913mm。本发明的20000升生物反应器的所述至少两个叶轮间的距离(也称为叶轮间距(Ds)优选1200mm以上至1700mm以下，更优选该叶轮间距为1498mm。本发明的20000升生物反应器的叶轮轴直径优选为51mm以上至64mm以下。如果本发明的20000升生物反应器具有挡板，则挡板的长度优选4000mm以上至4600mm以下，更优选该长度为4365mm。本发明的20000升生物反应器的挡板宽度优选 260mm以上至^Omm以下，更优选该宽度为279mm。本发明的20000升生物反应器的挡板间隙优选20mm以上至35mm以下，更优选该挡板间隙为观讓。本发明的20000升生物反应器的挡板高度(Heft)优选3600mm以上至4050mm以下，更优选该挡板高度为3882mm。本发明的20000升生物反应器优选具有至少一个分布器，更优选其具有两个分布器。如果本发明的20000升生物反应器具有两个分布器，则一个优选为控制分布器，一个优选为镇流分布器。本发明的20000升生物反应器的控制分布器优选具有3mm以上至5mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为4mm。本发明的20000升生物反应器的镇流分布器优选具有 5mm以上至7mm以下的喷嘴径或孔径，更优选该喷嘴径或孔径为6mm。本发明的20000升生物反应器的控制分布器的喷嘴数/孔数优选为230以上至270以下，更优选该喷嘴数或孔数为250。本发明的20000升生物反应器的镇流分布器的喷嘴数或孔数优选为85以上至 115以下，更优选该喷嘴数或孔数为100。用于控制和/分布器或镇流分布器的分布器长度 (Sl)优选500mm以上至2000mm以下，更优选该分布器长度为1077mm。对于控制分布器和/ 或镇流分布器，本发明的20000升生物反应器的分布器至罐底的间隙(S。)优选560mm以上至620mm以下，更优选分布器至罐底的间隙为593mm。对于控制分布器和/或镇流分布器， 本发明的20000升生物反应器的分布器至底部叶轮的间隙(D。-S。)优选300mm以上至:340mm 以下，更优选分布器至底部叶轮的间隙为320mm。从分离的分布器添加镇流(镇流分布器) 的要求，防止用镇流气体稀释氧或富氧DOT需求气体。为确保最好的氧传输速率(OTR)，从分布器形成的气泡的氧浓度梯度是最大的。其次，使用镇流分布器允许将分布器安置在不同的位置以避免为了 PC02控制而传递需要的镇流时影响DOT控制。镇流分布器能够独立于控制分布器而设计。用本发明的生物反应器设计，能够完成不同的传代培养比。在一种特别优选的实施方案中，完成的传代培养比为1比5(20% V/V)以上至1比9(11%V/V)以下，更优选1 比5(20% V/V)或1比9(11% V/V)的传代培养比。本发明还包括培养和增殖哺乳动物细胞的方法，特征在于，在本发明的生物反应器中在合适的培养基中在合适的培养条件下培养至少一个哺乳动物细胞。本发明的生物反应器包括具有至少两个叶轮并显示上述至少一个特征或不同特征的组合的所有生物反应器。在本发明的方法中，生物反应器的至少两个叶轮的搅拌速率优选55W/m3以上至 85ff/m3以下。优选地，以至少5X 10_5m/S的速度，更优选以至少IOX 10_5m/S的速度，将空气分布入培养基中。在本发明一种特别优选的实施方案中，通过优选在空间上彼此分离的两个添加孔加入碱，以分散碱。如果在罐中发生长再循环时间，这确保碱的快速混合。优选通过控制分布器来添加CO2。优选使用碱和/或(X)2来调节培养基的pH。优选控制探头和备用探头位于距罐底部913mm的下孔圈。在本发明一种优选的实施方案中，本发明的方法发生于体积为1000升的生物反应器中。在使用1000升生物反应器的方法中，使用的培养基体积优选在接种前期间为50 升至250升。在接种后期间，培养基的体积优选300升以上至960升以下。在转移前/收获期，在1000升生物反应器中的培养基体积优选300升以上至960升以下。在本发明的具有1000升体积的生物反应器中，最小操作体积(V·、)优选在80升至120升之间，更优选该最小操作体积为100升，最大操作体积(V)优选900升以上至1100升以下，该最大操作体积更优选为1000升。最小搅拌体积优选为230升以上至255升以下，更优选最小搅拌体积为245升。在具有1000升体积的生物反应器中，在最小操作体积时的液体高度(H·、)优选210mm以上至240mm以下，更优选在最小操作体积时该液体高度为2观讓。在具有1000 升体积的生物反应器中，在最大操作体积时的液体高度( )优选1500mm以上至1900mm以下，更优选在最大操作体积时该液体高度为1764mm。最小高宽比(Η·、/Τ)优选0. 15以上至0. 19以下，更优选该最小高宽比为0. 17。在本发明的方法中使用的具有1000升体积的生物反应器的最大高宽比Ot-T)优选1. 8以上至2. 1以下，更优选该最大高宽比为1. 96。 自由空间体积优选270升以上至310升以下，更优选该自由空间体积为293升。自由空间高度优选450mm以上至550mm以下，更优选该自由空间高度为500mm。总直线高度(H)优选 1900mm以上至2200mm以下，更优选总直线高度为2045mm。上探头圈(probe-ring)或样品圈(sample-ring)的高度优选900mm以上至1200mm以下，更优选上探头圈或样品圈的高度为1093mm。下探头圈或样品圈的高度优选152mm以上至观6讓以下。在本发明一种优选的实施方案中，本发明的方法发生在体积为4000升的生物反应器中。在使用4000升生物反应器的方法中，使用的培养基体积优选在接种前期间为1914 升至3077升。在接种后期间，培养基的体积优选2153升以上至3846升以下。在转移前/
11收获期，在4000升生物反应器中的培养基体积优选2153升以上至3846升以下。在本发明的具有4000升体积的生物反应器中，最小操作体积(V·、)优选在1500升至2200升之间， 更优选该最小操作体积为1900升，最大操作体积(V)优选3800升以上至4200升以下，该最大操作体积更优选为4000升。最小搅拌体积优选1500升以上至1800升以下，更优选最小搅拌体积为16M升。在具有4000升体积的生物反应器中，在最小操作体积下的液体高度 (ΗΛ/>)优选800mm以上至1200mm以下，更优选在最小操作体积下的液体高度为1024mm。在具有4000升体积的生物反应器中，在最大操作体积时的液体高度( )优选1800mm以上至 2200mm以下，更优选在最大操作体积时该液体高度为2034mm。最小高宽比(H^、/T)优选 0. 55以上至0.75以下，更优选该最小高宽比为0.63。在本发明的方法中使用的具有4000 升体积的生物反应器的最大高宽比Ot-T)优选1. 1以上至1. 4以下，更优选该最大高宽比为1.25。自由空间体积优选850升以上至1250升以下，更优选该自由空间体积为1039升。 自由空间高度优选450mm以上至550mm以下，更优选该自由空间高度为500mm。总直线高度 (H)优选2000mm以上至MOOmm以下，更优选总直线高度为2252mm。上探头圈或样品圈的高度优选1200mm以上至1600mm以下，更优选上探头圈或样品圈的高度为1403mm。下探头圈或样品圈的高度优选500mm以上至550mm以下，更优选下探头圈或样品圈的高度为531mm。在本发明一种优选的实施方案中，本发明的方法发生在体积为20000升的生物反应器中。在使用20000升生物反应器的方法中，使用的培养基体积优选在接种前期间为 13913升至17096升。在接种后期间培养基的体积优选17391升以上至19231升以下。在转移前/收获期，在20000升生物反应器中的培养基体积优选20000升以上至21739升以下。在本发明的具有20000升体积的生物反应器中，最小操作体积(V^、)优选在9000升至16000升之间，更优选该最小操作体积为13000升，最大操作体积(V)优选19000升以上至25000升以下，该最大操作体积更优选为22000升。最小搅拌体积优选为8100升以上至 8500升以下，更优选最小搅拌体积为8379升。在具有20000升体积的生物反应器中，在最小操作体积时的液体高度(H·、)优选2100mm以上至2500mm以下，更优选在最小操作体积时该液体高度为2309mm。在具有20000升体积的生物反应器中，在最大操作体积时的液体高度( )优选3550mm以上至3950mm以下，更优选在最大操作体积时该液体高度为3777mm。 最小高宽比(Η·、/Τ)优选0. 70以上至0. 99以下，更优选该最小高宽比为0. 83。在本发明的方法中使用的具有20000升体积的生物反应器的最大高宽比Ot-T)优选1. 2以上至1. 5 以下，更优选该最大高宽比为1.35。自由空间体积优选5750升以上至6500升以下，更优选该自由空间体积为6131升。自由空间高度优选900mm以上至IlOOmm以下，更优选该自由空间高度为1000mm。总直线高度(H)优选3700mm以上至4100mm以下，更优选总直线高度为3968mm。上探头圈或样品圈的高度优选2200mm以上至沈50讓以下，更优选上探头圈或样品圈的高度为Ml 1mm。下探头圈或样品圈的高度优选880mm以上至940mm以下，更优选下探头圈或样品圈的高度为913mm。对于具有20000升体积的生物反应器，优选使用的接种比为11 % ν/ν (1比9稀释) 或20% ν/ν(1比5稀释)，优选的补料应用为接种后体积的4% ν/ν至25% ν/ν。优选调整20000升生物反应器中接种后的体积，使补料应用达15%，以便在添加所有补料后到收获时最终体积为20000升。然而，对于大于15% ν/ν的补料应用，优选为了 15% ν/ν补料而调整接种后体积，但在补料应用后，最终收获前体积将为最小20000升至最大22000升。期望20000升生物反应器在批次结束时容纳总共20000升至22000升。具有20000升体积的生物反应器优选以10至15天的分批或分批补料模式来操作。本发明还包括用于培养哺乳动物细胞的生物反应器系统，所述生物反应器系统特征在于具有至少500升、优选至少1000升体积的a)第一生物反应器与体积大于第一生物反应器体积并具有至少2000升、优选至少4000升体积的b)第二生物反应器连接，并且其中所述具有至少2000升、优选至少4000升体积的第二生物反应器与本发明的体积大于第二生物反应器体积并具有至少10000升、优选至少20000升体积的c)第三生物反应器连接。在本发明一种优选的实施方案中，生物反应器系统特征在于生物反应器中至少一种为本发明的生物反应器。更优选，生物反应器系统的所有生物反应器均为本发明的生物反应器。在本文中，本发明的生物反应器为在说明书、实施例和权利要求书中描述的所有生物反应器。本发明的生物反应器也称为生物反应器列(train)或设备。生物反应器列优选包括不同的生物反应器，其也称为阶段。具有至少500升、优选至少1000升体积的生物反应器对应于阶段N-3和/或N-2。具有至少2000升、优选至少 4000升体积的生物反应器对应于阶段N-I。具有至少10000升、优选至少20000升体积的生物反应器对应于阶段N。根据需要设计生物反应器列，以确保诸如pH、溶氧张力(DOT)和温度之类的工艺参数方面的均相环境，在所述生物反应器中保持良好混合的细胞悬浮和使营养补料混合。 生物反应器列的生物反应器优选显示几何相似性。这允许在例如12升实验室规模或500 升中试规模开发按比例缩小模型。将阶段N-3、N-2和N-I的生物反应器用作种子生物反应器。将阶段N的生物反应器用作生产生物反应器。优选基于相同的原理设计种子生物反应器和生产生物反应器。然而，可以要求一些偏差以适应工艺中的灵活性。在本发明一种优选的实施方案中，高宽比Η/Γ为0. 17以上至1. 96以下。在本发明一种优选的实施方案中，存在另一生物反应器，尤其是对应于阶段N-4 的50升生物反应器。在本发明一种优选的实施方案中，N-4生物反应器是S-200Seed wave生物反应器或100升搅拌罐反应器。在本发明的一种优选实施方案中，液体(例如培养基)能够通过气动辅助流动或通过蠕动泵从一个生物反应器运输至另一生物反应器。本发明还包括培养和增殖哺乳动物细胞的方法，所述方法特征在于a)在具有至少500升体积、优选具有至少1000升体积的第一生物反应器中，在合适的条件下在合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞，b)将通过增殖至少一个哺乳动物细胞而获得的含细胞培养基转移入具有至少2000升体积、优选具有至少4000升体积的第二生物反应器，c)在所述具有至少2000升体积、优选具有至少4000升体积的第二生物反应器中培养被转移的细胞，d)将在步骤c)中获得的含细胞培养基转移入具有至少10000升体积、优选具有至少 20000升体积的第三生物反应器，以及e)在具有至少10000升体积、优选具有至少20000升体积的第三生物反应器中培养所述被转移的细胞。在本发明的一种优选实施方案中，所述方法特征在于所使用的生物反应器中至少一种为本发明的生物反应器，更优选所使用的所有生物反应器都是本发明的生物反应器。在本文中，本发明的生物反应器为在说明书、实施例和权利要求书中描述的所有生物反应器。步骤e)的生物反应器优选以分批或分批补料模式来操作。优选将细胞在步骤e) 中培养10至15天。步骤a)也称为阶段N-3和/或N_2。步骤c)也称为阶段N_1。步骤e)也称为阶段N。优选在步骤a)、c)和e)的生物反应器中的培养条件相同。更优选，在步骤a)、c) 和e)的生物反应器中的培养条件诸如pH、溶氧张力和温度的工艺参数方面的均相环境。优选在步骤a)、c)和e)中生物反应器中的pH、溶氧张力和温度相同。在本发明的一种优选实施方案中，在转移步骤b)和/或d)之后的接种比为至少 10% v/v，更优选11% v/v(l比9稀释)以上至30% ν/ν以下，更优选20% ν/ν (1比5稀释)。优选在步骤b)和d)中转移全部培养基或仅部分培养基。本发明进一步优选的实施方案为从属权利要求中的主题(subject-matter)。在接下来的实施例和附图中将更详细地说明本发明。
图1显示了本发明的生物反应器。1为生物反应器。10为罐(T)的直径。20为生物反应器的总直线高度(H)。30为生物反应器的基部高度(Hb)。40为生物反应器的顶部高度(Hh)。50为最大操作体积时的液体高度(HJ。60为顶部叶轮直径(Dw)。68为顶部叶轮。70为底部叶轮直径(Dlis)15 78为底部叶轮。80为罐底部与底部叶轮中线之间的间隙(Dc)。90为叶轮间距(Ds)。100为液体表面以下至顶部叶轮的间隙(D。)。108为分布器。110为分布器至罐底部的间隙(S。)。120为分布器至底部叶轮的间隙(D。-S。)。128为挡板。138为位于下圈的孔。148为位于顶部叶轮68中线的孔。图2显示了本发明的生物反应器系统。111为具有1000升体积的生物反应器。11 为具有4000升体积的生物反应。1为本发明的具有20000升体积的生物反应器。实施例1 :20000升生物反应器对于哺乳动物细胞培养，20000升生物反应器以分批或分批补料的模式运行10至 15天。通过经由叶轮系统的搅拌从而将哺乳动物细胞保持在均相悬浮液中。容器几何结构用于20000升生物反应器的容器几何结构通过反复设计基础来确定，在所述反复设计基础中改变最大工作体积、自由空间直线侧距离、高宽比凡/T以及叶轮与罐直径D/T 的比例，直到实现可接受的高宽比。生物反应器高宽比氏/T此关键设计参数允许对生物反应器几何结构进行表征。具有较高高宽比的罐提供较长气体驻留时间，其允许较大的Kp。然而，增加的顶部压力能够引起可溶气体的形成。在罐中较低的高宽比凡/τ可导致较短的气体驻留时间，从而要求较大气流用于充气，导致更多的泡沫产生。还通过Η/Γ来限制叶轮驱动的搅拌以增加Κρ，因为在低高宽比中将在下叶轮旋转时发生表面破坏(breakage)和产生涡旋。由此，高宽比的选择在很大程度上以在表1中列出的议题的经验为基础。表1 各种高宽比的效果总结
权利要求
1.一种用于培养哺乳动物细胞的生物反应器，其特征在于所述生物反应器(1)具有至少4000升的体积，以及至少一个顶部叶轮(68)和至少一个底部叶轮(78)，其中所述顶部叶轮(68)为水翼式叶轮。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述生物反应器(1)具有顶部叶轮(68)和底部叶轮(78)，所述顶部叶轮(68)优选为三叶水翼式设计的叶轮，所述底部叶轮 (78)优选为四斜叶大稠度叶轮。
3.根据前述任一权利要求中所述的生物反应器，其特征在于所述叶轮(60，70)与罐 (10)的直径比为0.35以上至0.55以下，优选0.40以上至0. 48以下，最优选0.44以上至 0. 46以下。
4.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述顶部叶轮的功率数 (Np)为0. 1以上至O·9以下。
5.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述顶部叶轮的流量数 (Nq)为0.4以上至0.9以下。
6.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述底部叶轮的功率数 (Np)为O·5以上至O·9以下。
7.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述底部叶轮的流量数 (Nq)为0. 50以上至0.85以下。
8.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述生物反应器(1)具有至少一个分布器(108)。
9.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述生物反应器(1)具有至少一个挡板(128)。
10.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述生物反应器(1)具有至少两个用于添加碱的(138，148)，所述孔优选空间上彼此分离。
11.根据前述任一项权利要求所述的生物反应器，其特征在于所述生物反应器(1)具有至少10000升的体积，最优选至少20000升的体积。
12.—种培养和增殖哺乳动物细胞的方法，其特征在于在权利要求1至11任一项所述的生物反应器中，在合适的培养条件下，在合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述至少两个叶轮的搅拌速率为55W/ m3以上至85W/m3以下。
14.一种用于培养哺乳动物细胞的生物反应器系统，其特征在于a)具有至少500升、优选至少1000升的体积的第一生物反应器(111)连接至b)体积大于所述第一生物反应器(1)并具有至少2000升、优选至少4，000升的体积的第二生物反应器(11)，其中所述具有至少2000升、优选至少4000升的体积的第二生物反应器(11)连接至c)权利要求1至16任一项所述的第三生物反应器(1)，所述第三生物反应器(1)具有至少10000升、优选至少20000升的体积，其体积大于所述第二生物反应器(11)的体积。
15.根据权利要求14所述的生物反应器系统，其特征在于所述第一或第二生物反应器(111、11)中的至少一种为权利要求1至11任一项所述的生物反应器。
16.一种培养和增殖哺乳动物细胞的方法，其特征在于a)在具有至少500升的体积、优选至少1000升的体积的第一生物反应器中，在合适的条件下，在合适的培养基中培养至少一个哺乳动物细胞，b)将通过增殖所述至少一个哺乳动物细胞而获得的含细胞培养基转移至具有至少 2000升的体积、优选至少4000升的体积的第二生物反应器，c)在具有至少2000升的体积、优选至少4000升的体积的所述第二生物反应器中培养被转移的细胞，d)将在步骤c)中获得的含有细胞培养基转移至第三生物反应器，所述第三生物反应器具有至少10000升的体积、优选至少20000升的体积，和e)在所述具有至少10000升的体积、优选至少20000升的体积的所述第三生物反应器中培养所述被转移的细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所使用的所述生物反应器中至少一种为权利要求1至11任一项所述的生物反应器。
18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于在步骤a)、c)和e)的所述生物反应器中的培养条件相同。
全文摘要
本发明涉及具有至少两个叶轮的大规模生物反应器、大规模生物反应器系统和使用这些生物反应器大规模培养和增殖哺乳动物细胞的方法。
文档编号C12M1/06GK102307984SQ201080007208
公开日2012年1月4日 申请日期2010年2月9日 优先权日2009年2月9日
发明者莫斯汗·肯 申请人:英国龙沙生物医药股份有限公司