专利名称：枯草芽孢杆菌菌种及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种枯草芽孢杆菌菌种，同时还涉及该枯草芽孢杆菌菌种在实现细菌型豆豉纯种发酵方面的应用。
背景技术：
豆豉主要以黑豆、黄豆为原料，利用微生物发酵而成的一种调味食品，其营养丰富、特有的豉香和鲜味，一直以来在豆制品中占有特殊的地位，成为独具特色的调味品和家常菜肴，深受消费者的欢迎。按发酵时参与的微生物不同，豆豉可分为毛霉型、曲霉型、根霉型和细菌型等；按发酵时是否加食盐，分为咸豉和淡豉；按成品含水量多少，分为干豉、湿豉和水豉。我国主要生产毛霉型、曲霉型豆豉及细菌型豆豉(俗称水豆豉)。在细菌型豆豉生产过程中，一直沿用传统的自然发酵方法进行生产，发酵过程中经常出现杂菌污染，产气、顶盖、二次污染和生产周期不稳定等现象，易产生毒素，这些因素成为制约企业生产发展的瓶颈。细菌型豆豉之所以至今没有实现纯种发酵，是因为豆豉在自然发酵过程中，芽孢杆菌、微球菌、乳酸菌和酵母菌等多种微生物共同作用，产生大量的复合酶分解大豆，从而得到风味优良的豆豉。单一纯种发酵通常只适宜生产生化反应简单、 成分单一、纯度较高和无风味要求的产品，不能满足生产营养丰富和风味要求较高的传统发酵食品。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种适宜工业纯种发酵的枯草芽孢杆菌菌种。本发明的另一目的在于提供该枯草芽孢杆菌菌种在在豆豉发酵生产中的用途。一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RH3519，其形态特征RH3519属芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌。生长曲线显示0- 为延滞期；4-1 为对数生长期；15-19h为生长稳定期；19h以后为衰亡期。菌落形态特征菌体宽0. 96 μ m,菌体长 4. 73 μ m ；革兰氏反应为阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间或稍偏；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；菌落形态不规则，表面干燥、不透明，浅褐色，容易挑起。不利用大豆中的糖类物质发酵产气。适宜生长温度在32°C-42°C之间。该菌种已于2010年10月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址中国北京中国科学院微生物研究所)，保藏号CGMCC N0:4255，名称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RH35190(一 )枯草芽孢杆菌菌种的分离步骤活化出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)MTJQ2 (已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏)和纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto CICC 10023)，枯草芽孢杆菌MTJQ2在对数生长期加入量为IOU ^171青霉素，甘氨酸加入2g -πιΓ1. 纳豆芽孢杆菌在对数生长期青霉素的适宜加入量为40U · mL—1，甘氨酸加入2g · mL—1。完全培养基培养池后收集菌体，使菌含量在1. 0-1. 5 X IO8个^r115 MTJQ2对溶菌酶比较敏感， 形成原生质体的最佳条件为酶浓度Ο.Οδπ^πιΓ1，35°C酶解5min。纳豆芽孢杆菌形成原生质体的最佳条件为酶浓度0. 50mg · !111^,351:酶解20min。原生质体悬液涂布于再生培养基上，用枯草芽孢杆菌MTJQ2的原生质体与纳豆芽孢杆菌的原生质体进行融合，稀释涂布于再生培养基上再生，挑取原生质体融合菌株发酵大豆后依据感官鉴定进行筛选。(二)菌种的培养完全培养基胰蛋白胨10g、酵母膏5g、氯化钠IOgdK 1000mL，pH7. 0。固体培养基加琼脂20g, 121°C灭菌20min。再生培养基LB完全培养基加入0. 5mol ·厂1甘露醇，0. 02mol · T1MgCl2 · 6H20, 121°C 灭菌 20min。(三)保种和传代牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、加水至1000mL。用5NNa0H 调 pH 7. 0-7. 2。LB培养基酵母抽提物5g，蛋白胨10g，NaCl 10g，加水至1000mL，5mol · L4NaOH 调 ρΗ7· 0-7. 2。以上为液体培养基。固体培养基需按2%添加琼脂，121 °C灭菌20min，冷却至 45-50°C时倒入培养皿中即可。保存方法有三种(1)每月一次，从已生长的固体或液体培养基按接种一环量接种到新的平板上或斜面试管中，32°C，30h。置于4°C保存。(2)用15 X 180mm的试管，盛琼脂培养基5mL，做成斜面，接种菌种，32°C，培养30h， 倒入IOmL左右灭菌石蜡油覆盖其上，置于4°C保存。3个月转种一次。(3)冻存法。接种LB液体培养基，320C，200rpm, 24h后添加20%的无菌甘油，混勻后无菌倒入冻存管中，置于-80°C保存。一年转种一次。(四)菌种的生态特征活化后的菌种的生长曲线为0- 为延滞期；4-1 为对数生长期；15_19h为生长稳定期；19h以后为衰亡期。菌落形态特征菌体宽0. 96 μ m,菌体长4. 73 μ m ；革兰氏反应为阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间或稍偏；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；菌落形态不规则，表面干燥、不透明，浅褐色，容易挑起。不能利用大豆中的糖类物质发酵产气。(五)菌种的培养特性(1)培养温度4°C -50°C，最适生长温度在32°C -42°C。(2)培养 pH4-9，最佳 pH 为 7. 0-7. 2。依照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等，1999) 进行理化鉴定，同时扩增16S rDNA测序后进行比对分析，确定本发明的豆豉芽孢杆菌菌种为芽孢杆菌科，芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌。由于该菌种是采用原生质体融合技术获得，特依据筛选数量命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RH3519。本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知该菌株发酵的豆豉风味和色泽与传统风味相似，食用安全。其发酵豆豉的氨基酸态氮含量与总酸均显著高于自然发酵的豆豉。采用水豆豉工业化调配工艺试生产，所获得的水豆豉成品品质显著优于自然发酵的豆豉，且外观色泽好，菌体粘丝覆盖豆豉表面。豆豉的风味酱香味浓郁， 而且回味较长，苦味较轻，口感的质地适中。豆豉的气味豉香诱人，且氨味较轻。菌株纯种强化发酵豆豉(》500kg)的试验结果表明，该菌株可作为工业生产菌株。
具体实施例方式(1)枯草芽孢杆菌MTJQ2菌种的分离、筛选和鉴定高产蛋白酶活性菌株的分离采用常规微生物学方法进行。取新鲜茅台酒曲20g，加无菌水lOOOmL，搅拌均勻。稀释平板法LB固体培养基分离单菌株。采用酪蛋白平板法检测菌株的产蛋白酶能力(要求h/c ^ 7)，菌株纯化后依据伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)进行鉴定，获得枯草芽孢杆菌MTJQ2菌株。(2)原生质体的制备已活化的纳豆芽孢杆菌和MTJQ2菌株，1 %接种至20mL完全液体培养基，37°C， 120rpm培养，对数生长期4-Mi收集菌体，3500rpm离心IOmin收集菌体，SMM液(0. 5mol/L蔗糖、0. 02mol/L 顺丁烯二酸、0. 02mol/LMgCl2 ·6Η20, NaOHijf ρΗ7· 2-7. 5，115°C灭菌 20min。) 洗涤2次，ImL SMM液悬浮。用血球计数板计算菌含量，使菌含量在1. 0-1. 5 X IO8个· Γ1。 分别加入梯度浓度的溶菌酶，置于水浴中35°C保温酶解。(3)原生质体再生取上述酶解后的原生质体液，在3500rpm离心IOmin收集原生质体。分别用无菌水和SMM液进行系列稀释，三个稀释浓度涂布平板，无菌水稀释液涂完全培养基平板，SMM 液稀释液涂再生培养基平板，每个平板涂O.lmL，每浓度涂3个平板。37°C下培养Mh。计算菌落数，在完全培养基上生长的菌落数乘以稀释倍数，为未被酶解的细菌数。在再生培养基上生长的菌落数乘以稀释倍数，为再生原生质体数和未被酶解的细菌数。
权利要求
1.一种豆豉芽孢杆菌(Bacillus subtilis)RH3519，其特征在于所述菌种的保藏号为 CGMCC NO :4255。
2.如权利要求1所述的豆豉芽孢杆菌RH3519在豆豉发酵生产中的用途。
全文摘要
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌菌种及其用途，菌体宽0.5μm，菌体长2.6μm；革兰氏反应为阳性；芽孢形状为椭圆，位于菌体中间；芽孢囊无膨大；无伴孢晶体；有鞭毛。菌落形态纯白色、形状不规则、菌落中心呈同心环状隆起、不透明、表面干燥、菌体微粘稠、易挑取。本发明的枯草芽孢杆菌菌种发酵生产豆豉色泽与自然发酵相似，且不产气、产酶能力较强、发酵风味较好的适宜工业纯种发酵生产豆豉。
文档编号C12N1/20GK102174435SQ20111002375
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月21日 优先权日2011年1月21日
发明者吴拥军 申请人:贵州大学