专利名称：一种hbv基因分型的pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种HBV基因分型的PCR熔解曲线检测方法。
背景技术：
乙型肝炎病毒(H印atitis B virus, HBV)主要通过宿主免疫机制引起肝脏损害， 机体免疫系统识别病毒抗原并攻击受感染的肝细胞引起炎症，这个过程受包括宿主与病毒 的多个因素影响。病毒基因异质性影响着抗原的表达，在此过程中也扮演着重要的角色。不 同的毒株出现某些变异的频率不同，不同毒株对机体免疫清除抵抗力不同以及其它的因素 均可能导致了不同基因型具有不同的感染后疾病谱。通常将HBV分为A H八种基因型，分型依据为全基因序列异质性彡8 %，或S 基因序列异质性彡4%。HBV基因型呈一定地理区域分布。我国北方以C型为主，南方以B 型为主，D型多见于少数民族地区，如西藏、新疆，不同基因型致病性不同。有研究证明HBV 的基因型不仅影响乙型肝炎患者病情进展，而且与抗病毒疗效和临床预后有一定的相关关 系。因此，HBV基因分型研究对进一步明确乙型肝炎发病机制、寻找治疗对策、实现流行病 学控制、以及对抗病毒治疗反应和病情预后评估均有重要意义。现在已经有一些HBV基因 分型的方法，其中测序法提供的信息全面可靠，但该方法繁琐、费时、实验条件和要求高，不 适宜广泛开展。而其他方法的结果均不如测序法可靠，目前仍然未被标准化和商业化，如 PCR-RFLP操作繁琐，且酶切位点易受基因变异的影响影响结果判断；PCR微板核酸分子杂 交-ELISA法操作技术简便，适用于一般实验室测定，但无法对血清HBsAg阴性的HBV感染 进行基因分型；型特异性引物PCR操作相对简单、结果准确，但仍需进行两轮PCR，产物电泳 的步骤，存在产物污染的可能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种HBV基因分型的PCR检测方法，该方法能够简便、快 速、准确地鉴定HBV基因型。本发明的技术方案如下
根据乙型肝炎病毒基因型的全基因组序列设计引物；在上述引物的存在下，在荧光 PCR仪中，对从血清样品提取的DNA进行PCR扩增，利用熔解曲线分析PCR产物，根据PCR产 物的Tm值来判断基因型，实现乙型肝炎病毒的基因分型。其中所述乙型肝炎病毒基因型为乙型肝炎病毒基因型B，引物序列如下 上游引物 BF :AGTTAATCATTACTTCCAGACGC
下游引物 BR CTGTAGATCTTGTTCCCAAGAAT
所述乙型肝炎病毒基因型为乙型肝炎病毒基因型C，引物序列如下 上游引物 CF TGTTCCGACTACTGCCTCAC 下游引物 CR GGACAAATTGGAGGACAAGAG 上述引物的设计步骤为根据文献(吴光华，丁惠国，曾长青.公共核算数据库乙肝病毒全基因组序列概况和中国HBV参照序列的建立.自然科学进展，2008，18:121-129.) 报道的中国HBV B、C型的全基因组序列，按照引物的设计原则，利用I^rimer Premier 5.0 软件自行设计B、C型特异性引物，之后到Pubmed数据库上进行blast，证实引物的目的扩 增片段为HBV的基因序列；根据扩增片段的Tm值来判断基因型。所述PCR扩增的条件为采用50 μ L的反应体系，2倍浓缩的STOR Premix Ex Taq 25 μ L，引物对 10 μ M/L 各 1 μ L，50 倍浓缩的 ROX Reference Dye 1 μ L,HBV DNA 模板 4 μ L， dH20 16yL ；于ABI7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件95°C 30s，然后按95°C 5s, 60°C 31s，进行40个循环，荧光检测在60°C。荧光通道检测选择STOR。针对我国HBV基因型主要以B型和C型为主的特点，本发明只设计了 B、C型的引 物，建立了 PCR熔解曲线检测HBV B、C及B/C混合基因型的方法。本方法采用STOR Green I的熔解曲线来检测HBV基因型，SYBR Green I是一种不对称腈类荧光素，能非特异性地 嵌合于DNA双螺旋结构中的小沟内，一般不与单链DNA结合，结合状态的荧光强度较之游离 状态的荧光增加数千倍。HBV双链DNA分子因与STOR Green I结合而被识别，当两条DNA 分子复性结合时荧光最强，随温度上升荧光强度降低并出现一较恒定的坡度，当温度达到 Tm值时荧光强度急剧下降。经过软件分析可得到熔解曲线图，其波峰所在的温度代表双链 DNA分子的Tm值。Tm值的大小取决于DNA分子的长度及其序列中G/C含量。本发明设计 的两对型特异性引物扩增的DNA分子片段长度不同，其中B型130bp，C型27!3bp，具有不同 的Tm值，因此可根据PCR产物的Tm值来判断基因型。PCR熔解曲线法在一个PCR反应体系 中同时加有两对引物，方法简单易行，耗时较少，每次可同时检测96个标本，耗时2小时，由 于整个扩增和检测过程均为闭管操作，不需开盖吸取扩增产物进行电泳，避免了 PCR扩增 产物的污染，减少了假阳性结果。某一型的引物只与相同型的模板结合才发生PCR扩增反 应，从而保证了检测的特异性，同时，本发明扩增片段短，采用较高的退火温度，也可以保证 扩增的特异性。反应体系经荧光定量PCR仪扩增后即可通过Tm值简便、快速地鉴别HBV基 因型。本发明的显著优点
本发明建立的PCR熔解曲线法操作简便，与商品化的基因分型试剂盒的检测结果相比 有较高的符合率，可用于临床上HBV基因型的检测。本发明在利用PCR技术的基础上，建立了一种依据Tm值判断HBV基因型的PCR熔 解曲线法，能简便快速、准确地鉴定HBV基因型。
图1为PCR熔解曲线法检测HBV基因型B、C的典型曲线图，其中横坐标为温度 (0C),纵坐标为荧光值的二次导数。图2为PCR熔解曲线法检测HBV基因型B/C混合型的典型曲线图，其中横坐标为 温度rc )，纵坐标为荧光值的二次导数。
具体实施例方式以下为本发明的具体实施例子，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1一、对象
2009年福建医科大学附属第一医院住院及门诊的186例HBV感染患者，男IM例，平 均年龄35. 21岁，女69例，平均年龄35. 71岁，其血清荧光定量PCR检测均为HBV DNA阳性 (IO3 IO8拷贝/ml)，保存于-80°C。所有患者均排除了甲、丙和戊型肝炎病毒感染和其他 导致肝脏病变的疾病，且诊断符合2000年中华医学会传染病与寄生虫学分会(西安)修订的 诊断标准。二、方法
1.主要的实验仪器与试剂ABI7000荧光定量PCR仪(美国)，病毒基因组DNA提取试 剂盒(购自上海捷瑞生物工程有限公司)，STOR Premix Ex Taq (购自大连宝生物工程 有限公司)，乙型肝炎病毒基因分型荧光PCR检测试剂盒(购自上海复星医学科技发展有限 公司)，其它化学试剂均为国产化学纯。2.引物设计根据文献(吴光华，丁惠国，曾长青.公共核算数据库乙肝病毒全 基因组序列概况和中国HBV参照序列的建立.自然科学进展，2008, 18:121-129.)提供的 B、C型的全基因组序列，共设计四条引物，由大连宝生物工程有限公司合成，具体情况见表 1。表1本发明的PCR熔解曲线法所用引物
权利要求
1.一种HBV基因分型的PCR检测方法，其特征在于所述方法的步骤为根据乙型肝炎 病毒基因型的全基因组序列设计引物；在上述引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样 品提取的DNA进行PCR扩增，利用熔解曲线分析PCR产物，根据PCR产物的Tm值来判断基 因型，实现乙型肝炎病毒的基因分型。
2.根据权利要求1所述的HBV基因分型的PCR检测方法，其特征在于所述乙型肝炎 病毒基因型为乙型肝炎病毒基因型B，引物序列如下上游引物 BF :AGTTAATCATTACTTCCAGACGC下游引物 BR :CTGTAGATCTTGTTCCCAAGAAT。
3.根据权利要求1所述的HBV基因分型的PCR检测方法，其特征在于所述乙型肝炎 病毒基因型为乙型肝炎病毒基因型C，引物序列如下上游引物 CF TGTTCCGACTACTGCCTCAC下游引物 CR GGACAAATTGGAGGACAAGAG
4.根据权利要求1所述的HBV基因分型的PCR检测方法，其特征在于所述PCR扩增的 条件为采用50 μ L的反应体系，2倍浓缩的STOR Premix Ex Taq 25 μ L，引物对10 μ M/L各 1 μ L，50 倍浓缩的 ROX Reference Dye 1 μ L, HBV DNA 模板 4 μ L，dH20 16 μ L ；于 ΑΒΙ7000 荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件95°C 30s，然后按95°C 5s, 60°C 31s，进行40 个循环，荧光检测在60°C。
全文摘要
本发明提供了一种HBV基因分型的PCR检测方法。该方法根据乙型肝炎病毒基因型的全基因组序列设计引物；在上述引物的存在下，在荧光PCR仪中，对从血清样品提取的DNA进行PCR扩增，利用熔解曲线分析PCR产物，根据PCR产物的Tm值来判断基因型，实现乙型肝炎病毒的基因分型。本发明建立的PCR熔解曲线法操作简便，与商品化的基因分型试剂盒的检测结果相比有较高的符合率，可用于临床上HBV基因型的检测。本发明在利用PCR技术的基础上，建立了一种依据Tm值判断HBV基因型的PCR熔解曲线法，能简便快速、准确地鉴定HBV基因型。
文档编号C12Q1/70GK102140537SQ20111002410
公开日2011年8月3日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者商红艳, 欧启水, 程祖建 申请人:福建医科大学附属第一医院