专利名称：：人工优化合成的Epsps基因与重组载体以及改变作物抗性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种人工优化合成的Epsps基因(即5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因)，含有该基因的重组载体，以及利用所述含有该基因的重组载体改变作物抗性的方法。
背景技术：
：草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型的除草剂，它能经济地防除几乎全部杂草，对人畜毒性很低，在土壤中易被微生物分解，残留低，是世界上产量最大、应用最广的除草齐U。草甘膦毒性作用机理就是竞争性抑制莽草酸途径中催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)合成5-烯醇式丙酮酰-3-磷酸莽草酸(EPSP)的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)，该合成酶是真菌、细菌、藻类、高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中一个关键性的酶。草甘膦专一性地抑制EPSP合成酶的活性导致分枝氨基酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，从而扰乱了生物体正常的氨基酸合成与氮代谢而使其死亡。由于草甘膦是一种非选择性除草剂，所以在除去杂草的同时，也会杀死农作物。因此，通过基因工程技术开发抗草甘膦基因，获得草甘膦抗性农作物，对农业生产和草甘膦工业发展都有促进作用。目前，通过基因工程获得草甘膦抗性的策略主要有三个一是修饰草甘膦作用的靶蛋白编码基因，使其表达的酶蛋白对草甘膦不敏感；二是促使相关酶过量表达，使植物吸收草甘膦后仍能正常代谢；三是引入草甘膦降解基因和酶系统，在草甘膦发生作用前将其降解。自从Comai等(1983)从鼠伤寒沙门氏菌中分离出了抗草甘膦的突变基因aroA基因以来，许多研究者对抗草甘膦基因进行了研究。通过对来自细菌、真菌和植物的EPSP合成酶的序列比较，已经确定EPSP合成酶是除草剂草甘膦的作用靶标。目前发现的EPSP合成酶主要有两类。第一类是从鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonellatyphimurium)和大肠杆菌(Escherichiacoli)中克隆得到的；第二类是从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens),无色杆菌(Achromobacter),假单胞菌(Pseudomonas),枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)和金黄葡萄球菌(Staphylococccusaureus)中克隆的。第二类EPSP合成酶的氨基酸同源性相对保守，但第二类EPSP合成酶的酶动力学效率比第一类EPSP合成酶的高(王宏伟等，2007)。很多E.coil及S.typhimrium的突变体中都含有编码EPSP合成酶的aroA基因。Comai等(1985)对S.typhimrium进行化学诱变,将突变发生在部分结构基因上的aroA基因转入大肠杆菌，获得了抗草甘膦的高效表达。这说明突变的抗除草剂基因可以在很大程度上提高细菌或者植物对草甘膦的抗性能力。何鸣等(2002)利用E.coil及S.typhimrium的EPSP合成酶基因的重组，获得突变的Epsps(aroAM12)基因。研究结果表明aroAM12基因在植物基因转化中，既可以用作抗除草剂基因，又可以代替常用的抗生素标记，用作植物筛选标记基因。据美国孟山都公司的专利报道，在几种天然抗草甘膦细菌(根癌农杆菌CP4、无色杆菌LBAA、假单胞菌PG2982等)中分离克隆到了抗草甘膦的EPSP合成酶。这类酶表现出了对草甘膦的高抗性和对底物(PEP)的高亲和力(Padgetteetal.，1995)，不论草甘膦存在与否都有相似的催化特性。此类抗草甘膦基因已被应用于商品化转基因作物的生产中，如抗草甘膦转基因大豆，玉米，棉花以及油菜等，其中以孟山都公司为主。Ye等(2001)通过质体转化技术将无色杆菌、农杆菌、枯草杆菌的Epsps基因导入烟草中，在烟草的营养组织和生殖器官中都获得高水平的草甘膦抗性，虽然在营养组织和生殖器官中EPSPS的积累量不同导致在二者对草甘膦的抗性不同。获得的抗草甘膦植物喷洒草甘膦后，由于抗草甘膦的EPSP合成酶继续起作用，提供植物所需的芳香族氨基酸，故而不受影响。但EPSP合成酶常表现出与其底物PEP的结合能力降低的情况，只有农杆菌中分离的EPSP合成酶不仅活性高，而且紧密地与其底物PEP结合。姚姝等(2006)分别将来源于大肠杆菌的aroA基因和农杆菌Epsps基因转入拟南芥，试验结果表明转Epsps基因的拟南芥植株比转aroA基因拟南芥植株对草甘膦具有更高的抗性。
发明内容本发明的目的是提供一种人工优化合成的Epsps基因，含有该基因的重组载体，以及利用含有该基因的载体改变作物抗性的方法。本发明提供一种人工优化合成的Epsps基因，其特征在于，该基因具有SEQIDNo:1所示的序列，且该基因能编码具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽。本发明还提供一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有上述基因。此外，本发明还提供一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将上述的重组载体转化进所述作物中，使得到的转基因作物具有除草剂抗性。根据本发明的方法对水稻进行转基因，得到的转基因水稻及其后代作物耐受至少0.83g/m2的草甘膦。说明本发明的Epsps基因转入作物中后，能够使转基因作物及其后代作物均具有良好的抗草甘膦的特性。附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中图1a为pET32a-EpSpSISA重组载体表达产生的EPSPS蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，图1b为pET32a-EpSpSISA重组载体表达产生的EPSPS蛋白经N1-NTA树脂柱纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图2为植物表达载体p3300-EpSpSISA的构建流程图；图3a为检测转基因植株中Epspsisa基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图3b为检测转基因植株中Bar基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，图3c为检测转基因植株中EpspsISA基因的相对荧光定量PCR的柱状图；图4为非转基因植株对照(7001S)和EB7001S-0至EB7001S-8转基因植株T2代种子分别在含草甘膦和含草铵膦的培养基中的发芽结果；图5a为转基因植株EB7001S的T2代盆栽植株喷洒草甘膦的抗性实验结果，图5b为转基因植株EB7001S的T2代盆栽植株喷洒草铵膦的抗性实验结果。具体实施例方式本发明提供一种人工优化合成的Epsps基因，其特征在于，该基因具有SEQIDNo:1所示的序列(EpspsISA基因)，且该基因能编码具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS或EPSP合成酶)活性的多肽。所述Epsps基因按照水稻偏爱密码子的分布原则，置换原Epsps基因序列(序列见专利US005804425A)中的部分密码子，优化后获得本发明的因序列。人工优化后的EpspsISA基因、水稻基因及原始的Epsps基因序列的密码子相对使用度(RSCU值)如表I所示。与水稻和原始Epsps基因序列的密码子相对使用度(RSCU值)相比，该序列中密码子6(1\604、01\0^、044、066、1'(1'和11^的分布提高。同时，为了防止DNA序列甲基化的可能，该序列中降低了GCG、ACG、CCG、TCG、GGG和CAG密码子的分布。优化获得的EpspsISA基因序列的长度为1371bp，与原始Epsps基因相比，改变碱基163个，占碱基总数的11.89%，更改密码子138个，占整个密码子的30.20%,G+C含量为59.94%。根据本发明，在具有SEQIDNo:1所示的序列的前提下，只要该基因能编码具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽，可以在Epspsisa基因的两端添加任意类型和数目的其他碱基，这些基因也应在本发明的范围内。例如，可在Epspsisa基因上连接适当的定位信号序列，定位信号序列能够使外源蛋白产生或定向运输到细胞的特定部位，如叶绿体、内质网和液泡等，这些特定区域能够为外源蛋白提供一个相对稳定的环境，有效防止外源蛋白的降解，可明显提高外源蛋白的稳定性和积累量，从而提高植物相对应的抗性水平。因此，所述Epsps基因的5’端优选还含有SEQIDNo:2所不的序列，且该基因能编码N端带有TSP信号肽的、具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽。其中，SEQIDNo2所示的序列为编码TSP信号肽的序列，TSP信号肽能够使表达后的EPSP合成酶靶向性的运输到细胞的叶绿体内。本发明对于SEQIDNo:2所示的序列与SEQIDNo1所示的序列的连接方式没有特别的限定，只要二者位于同一阅读框，能够表达N端带有TSP信号肽的、具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽即可。优选地，SEQIDNo2所示的序列与SEQIDNo1所示的序列通过限制性酶切位点连接,共同形成SEQIDNo6所示的序列(即TspEpspsISA基因)，够编码N端带有TSP信号肽的、具有EPSP合成酶活性的多肽。在TSP信号肽的引导下，EPSP合成酶靶向性的运输到细胞的叶绿体内。叶绿体内是EPSP合成酶作用的场所，可明显提高EPSP合成酶的稳定性和积累量，从而提高植物相对应的抗性水平。但是，本领域技术人员可以确定的是，SEQIDNo:6所示的DNA序列仅是本发明的一种优选实施方式，本发明所述能够编码N端带有TSP信号肽的、具有EPSP合成酶活性的多肽的序列并不限于SEQIDNo6所示的DNA序列。要想把功能基因(即EpspsISA基因)转入作物中稳定表达，需要有完整的基因表达框，即，功能基因上游有启动子序列、下游有终止子序列。启动子序列和终止子序列在功能基因表达时起到控制功能基因转录的起始部位、转录强度和终止部位的作用，它并不影响功能基因表达出的蛋白质的氨基酸组成和结构，对于功能基因赋予的除草剂抗性特征没有任何的影响。因此，本发明中，可以选择任何能够适用于植物基因表达的启动子、终止子序列与功能基因形成不同组合的基因表达框。选择合适的植物启动子和改进活性可增强外源基因的表达。目前在植物表达载体中应用的启动子有组成表达型启动子(例如CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子、Actinl启动子等)、诱导表达型启动子(例如创伤诱导表达启动子、光诱导启动子rbcS、四环素诱导表达启动子等)、组织特异表达型启动子(例如花药绒毡层特异表达启动子TA29、胚乳特异表达启动子、维管束特异表达启动子等)等。因此，优选地，所述Epsps基因的3’端还含有SEQIDNo3所示的序列(Nos序列)作为EPSP合成酶表达的终止子。根据本发明，优选地，所述Epsps基因的5’端还含有SEQIDNo4所示的序列和SEQIDNo5所示的序列分别作为5-烯醇丙酮酰莽草酸_3_磷酸合成酶表达的启动子和增强子。其中，SEQIDNo:4所示的序列为来源于单子叶植物玉米的Ubiquitin(Ubi)启动子，作为表达EPSP合成酶的启动子，且该启动子还优选带有增强子Q序列(SEQIDNo:5)，Ubi启动子与Q序列之间可通过任何本领域公知的方式连接，例如通过限制性酶切位点连接，本发明优选通过BamHI限制性内切酶识别序列连接(即，通过GGATCC连接)。为了将基因连入载体，需要在其两端引入适当的限制性内切酶识别序列，所述限制性内切酶识别序列的选择和引入的方法也是本领域技术人员公知的。本发明中，将由TSP信号肽序列、人工优化的功能基因(EpspsISA基因)序列和Nos终止子序列组成的序列的两端添加内切酶切识别序列，5’端添加限制性内切酶SmaI的识别序列(cccggg)、3’端添加限制性内切酶SacI的识别序列(gagctc)，形成SEQIDNo7所示的序列，命名为TEN序列。SEQIDNo:7所示的序列为全新序列，可以通过基因人工合成的方法合成出来，该合成方法为本领域的常规方法，为许多公司采用作为商业化技术服务提供，如宝生物公司，上海生工生物技术有限公司等。本发明中，SEQIDNo:7所示的序列与增强子之间的连接方式可以为本领域常规的连接方式，例如，可以通过限制性内切酶识别序列连接，也可以在处于同一阅读框的前提下，相距更长的距离。本领域技术人员可以根据需要选择和调整SEQIDNo:7所示的序列与增强子之间的连接方式。本发明中，优选通过一个限制性内切酶识别序列连接。本发明提供一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有上述基因。本发明中，所述重组载体由上述基因序列和载体组成，所述载体可以为T载体、原核表达载体和真核表达载体中的至少一种，其中，T载体和原核表达载体的主要作用是初步验证功能基因和目标蛋白的功能，而真核表达载体的作用是为了后续将其转化进作物中，因此，能够满足上述应用的各种T载体(pMD18-T、pMD19-T等)、原核表达载体(pET32a等)和真核表达载体(pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等)均可用于本发明。优选地，该载体还含有SEQIDNo4(即Ubi启动子)和SEQIDNo:5(即Q增强子序列)所示的序列作为表达EPSP合成酶的启动子和增强子，能够用于表达N端带有TSP信号肽的EPSP合成酶。Ubi启动子与Q序列之间由内切酶BamHI识别位点连接,如图4所示。本发明还提供一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将上述重组载体转化进所述作物中，使得到的转基因作物具有除草剂抗性。根据本发明，术语“作物”为本领域公知的概念，指大面积栽种或大面积收获，供盈利或口粮用的植物。本发明的基因不仅可用于转入水稻，也可以用于转入玉米、高粱、小麦、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜等。优选地，所述作物为水稻，所述水稻包括各种水稻，如各亚种(籼稻、粳稻、爪哇稻)、各生态型(早稻、中稻、晚稻)水稻等。为了将该基因应用于两系法杂交水稻的育种，本发明中，所述水稻为光温敏核不育系水稻，具体地，可为光温敏核不育系水稻7001S、农垦58S、P88S、4008S、Y58S、培矮64S、N5088S、香125S、测64S、广占63S、GD-2S等。优选地，本发明中选光温敏核不育系水稻7001S作为转化的受体作物。实现转基因的方法有本领域公知的农杆菌介导转化法、基因枪法和花粉管通道法等。优选地，本发明所用的转化方法为农杆菌介导转化法。所述农杆菌介导转化法可以为传统的常规法，如(YukohHiei,etal.TransformationofricemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantMolecularBiology,(1997)35,p205_218)中报道的方法，也可米用(SeiichiToki,etal.EarlyinfectionofscutellumtissuewithAgrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.ThePlantJournal,(2006)47，p969-976.)中报道的快速转化方法。本发明的发明人对现有技术的快速农杆菌转化法进行了改进，具体地，SeiichiToki等人进行农杆菌转化时，愈伤组织诱导后不进行继代而直接浸染，而本发明的发明人发现，根据所用的愈伤组织的状态，诱导产生的愈伤组织继代后第3天达到最佳状态时再进行浸染能够得到更高的侵染效率。S卩，优选地，所述农杆菌转化法包括，用上述的重组载体的农杆菌菌液与作物的愈伤组织共培养，并对共培养后的愈伤组织进行筛选、预分化和分化，其中，所述愈伤组织为诱导后继代的愈伤组织。此外，本发明的发明人发现，农杆菌转化法中，在共培养和预分化愈伤组织时，所用固体培养基中的琼脂粉含量为10_15g/L，优选为12g/L能够使愈伤组织的状态良好，分化效率提高。术语“除草剂抗性”是指作物具有一定耐受除草剂的能力。本发明中，所述除草剂抗性为抗草甘膦的抗性；优选地，所述除草剂抗性为耐受至少0.83g/m2剂量的草甘膦。根据本发明，为了对转基因后的植物进行筛选，转化方法还优选包括将筛选标记基因转化进同一作物中。所述筛选标记基因为本领域任何能够作为筛选标记的基因，如Bar基因(序列如SEQIDNo:8所示)、Hpt基因、NptII基因等。本发明中，优选使用Bar基因作为筛选标记基因。Bar基因除了作为筛选标记外，还能使转入Bar基因的作物具有抗除草剂草铵膦的抗性。这样该转基因作物具有两种除草剂(草铵膦、草甘膦)的抗性，使得该作物对除草剂的适应能力进一步提高，田间防除杂草操作更加方便。下面，通过以下实施例对本发明做更详细的说明。其中，DNA序列SEQIDNo:7委托大连宝生物公司合成；各种PCR引物的合成和基因测序工作委托华大基因公司进行；各种酶均购自大连宝生物公司；pET32a(+)载体购自Invitrogen公司，其基因序列可参见http://www.merck-chemicals.com/life-science-research/vector-table-pet-32a-plus-vector-sequence/c_yvGb.sIODnQAAAEhqHQLddStWFSimpleSearch—NameOrID=pET32a&BackButtonText=search+results;pCAMIA3300载体提供自澳大利亚农业分子生物学应用中心(CAMBIA，http://www.cambia.org);质粒的提取、纯化和酶切以及其他常规分子生物学操作参考《分子克隆》(科学出版社，第三版)进行。本发明实施例中，所用作物为粳稻光温敏核不育系7001S，由安徽省农业科学院选育。农杆菌菌株为EHA105。本发明的农杆菌转化方法为对SeiichiToki,etal.2006(SeiichiToki,etal.EarlyinfectionofscutellumtissuewithAgrobacteriumallowshigh-speedtransformationofrice.ThePlantJournal，(2006)47，p969-976.)的方法进行改良的方法，二者不同的是，改良后的方法中，诱导产生的愈伤组织继代一次，继代后第3d进行浸染；且在共培养和预分化阶段均将固体培养基中的琼脂粉含量提高至12g/L。实施例1本实施例用于说明人工优化的Epspsisa基因的构建方法查找原始Epsps基因的DNA序列(见专利US005804425A),分析原始Epsps基因序列的密码子的相对使用度(RSCU值)(见表I第5列)和水稻蛋白编码序列的密码子的相对使用度(RSCU值)(见表I第4列)。根据分析，在保持原EPSP合成酶的氨基酸组成、顺序不变的情况下，用水稻偏爱密码子置换原始Epsps基因序列中相应的密码子，最终获得优化后的Epsps基因(序列如SEQIDNo:1所不)，命名为EpspsISA基因。分析优化后的EpspsISA基因，密码子的相对使用度(RS⑶值)如表I中第3列所示，与水稻和原始Epsps基因序列相比，优化后的EpspsISA基因序列的密码子GCT、GCA、CCT、CCA、CAA,CGG,TCT和TCA的分布提高；同时为了防止DNA序列甲基化的可能，降低了GCG、ACG、CCG、TCG、GGG和CAG的分布。获得的EpspSisa基因序列长度为137Ibp，与原始Epsps基因的DNA序列相比，氨基酸组成、顺序不变，改变碱基163个，占碱基总数的11.89%，更改密码子138个，占整个密码子的30.20%，G+C含量为59.94%。表I权利要求1.一种人工优化合成的Epsps基因，其特征在于，该基因具有SEQIDNo:1所示的序列，且该基因能编码具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽。2.根据权利要求1所述的基因，其中，该基因的5’端还含有SEQIDNo:2所示的序列，且该基因能编码N端带有TSP信号肽的、具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽。3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的3’端还含有SEQIDNo:3所示的序列作为5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶表达的终止子。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的基因，其中，该基因的5’端还含有SEQIDNo4所示的序列和SEQIDNo:5所示的序列分别作为5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶表达的启动子和增强子。5.一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有权利要求1-4中任意一项所述的基因。6.一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求5所述的重组载体转化进所述作物中，使得到的转基因作物具有除草剂抗性。7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述作物为水稻。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述作物为光温敏核不育系水稻7001S。9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述除草剂抗性为抗草甘膦的抗性。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述除草剂抗性为耐受至少O.83g/m2剂量的草甘膦。全文摘要本发明提供一种人工优化合成的Epsps基因，其特征在于，该基因具有SEQIDNo1所示的序列，且该基因能编码具有5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶活性的多肽。本发明还提供一种重组载体，其特征在于，该重组载体插入有上述基因。此外，本发明提供一种改变作物抗性的方法，其特征在于，该方法包括将上述重组载体转化进所述作物中，使得到的转基因作物具有除草剂抗性。根据本发明的方法对水稻进行转基因，得到的转基因水稻及其后代作物耐受至少0.83g/m2的草甘膦。说明本发明的Epsps基因转入作物中后，能够使转基因作物及其后代作物均具有良好的抗草甘膦的特性。文档编号C12N15/63GK102994526SQ20111027090公开日2013年3月27日申请日期2011年9月14日优先权日2011年9月14日发明者肖国樱,邓力华申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所