专利名称：产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用，具体是指产丁醇基因工程菌构建及其构建得到的一株菌株，还涉及利用该菌株发酵生产丁醇的方法。
背景技术：
丁醇是一种重要的有机溶剂和精细化工原料，也是一种洁净的可再生能源，目前丁醇在美国的市场已达到每年1300万吨。由于丁醇的化学合成法的原料是以石油为基础的丙烯，随着石油价格的迅猛增长，石油化工生产丁醇成本也随之增长，因此生物发酵法生产丁醇受到广泛关注。目前生物发酵法(ABE发酵法)生产丁醇主要通过丙酮丁醇梭菌属发酵产生， 包括 Clostridium acetobutylicum, C. beijerinckii, C. pasteurianum, C.saccharoperbutylacetonicum, C. tetanomorphum, C. saccharoacetobutyIicum等。随着生物技术、代谢工程、基因工程技术的飞速发展，采用分子生物学手段，构建遗传稳定的基因工程菌生产丁醇成为研究的热点，除了对产丁醇梭菌进行遗传改造之外，还在其他微生物系统中重构丁醇代谢途径，如大肠杆菌等。现有技术中，利用基因工程技术对大肠杆菌的代谢途径进行加工改造，构建的大肠杆菌工程菌已能够产生丙酮、丁醇。Bermejo等人构建了一个包含基因Γ adhe , etf他絮Uhil )的质粒pACT，并转入大肠杆菌，首次构建了产丙酮的大肠杆菌工程菌，发酵后能够产生2. 32 g/ L的丙酮；Inui等将来源于丙酮丁醇梭菌ATCC 824中合成丁醇途径的关键基因thil、hbd、crt、bcd~etfB~etfA > adti^L,分别编码硫解酶、3-羟基丁酰-CoA脱氢酶、巴豆酸酶、丁酰-CoA脱氢酶和醛/醇脱氢酶在大肠杆菌中表达，酶的活性有所改变，基因工程菌发酵后产生I. 18 g/ L 丁醇；Nielsen等IE. coli中构建了丙酮丁醇梭菌的丁醇代谢路径，直接表达多顺反子能够得到34 mg/L丁醇，分别表达单独顺反基因，丁醇产量能达到200 mg/L，若同时表达酵母甲酸铵脱氢酶基因，及过表达大肠杆菌的3-磷酸脱氢酶，丁醇产量可提高到580 mg/L ；Shen等人在大肠杆菌中构建了经过修饰的丙酮丁醇梭菌代谢途径，得到了 Ter (酰基CoA转移酶)催化的不可逆转反应产生了 NADH和乙酰辅酶A驱动力，并使用气提手段使重组菌株厌氧发酵能够产生30 g/ L的丁醇。上述现有技术表明克隆丁醇合成中编码关键酶的基因，进一步在大肠杆菌中进行表达，构建的大肠杆菌工程菌能够产生丁醇。
发明内容
本发明的技术目的在于提供了一种新的产丁醇基因工程菌的构建方法和菌株，使得该构建方法是一种构建含有克氏梭菌丁醇合成途径中关键基因catl、sucD'Mibd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌ATCC 824中的基因bcd-etfB-etfA、adh^的从丁二酸到丁醇的代谢途径方法，且本发明的菌株能够为产丙酮丁醇大肠杆菌的基因工程研究奠定基础。为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案。
一、本发明所述的产丁醇基因工程菌的构建方法。本发明以缺乏乳酸脱氢酶基因(7 ^)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7们活性的菌株为出发菌，重组表达基因 catl、sucD'Ahbd、cat2^ abfd、bcd~etfB~etfA> adti^L,获得产丁醇基因工程菌，重组菌株的代谢途径如图I所示。具体步骤如下
O以克氏梭菌基因组DNA为模板，分别纯化扩增出cat I、sucD、Ahbd、cat2、abfd基M，插入到表达质粒pTrc99a相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒pTrcCKL_5 ；
2)以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出基因后，插入到表达质粒pGEM-T Easy相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A ；
3)以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出没基因后，插入到中间重组质粒T-A相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A-B ；
4)以中间重组质粒T-A-B为模板，纯化扩增出的trc-acim-bcd-etfB-etfA基因后，插入中间质粒pTrc99CKL-5相应的酶切位点之间、连接获得最终重组质粒pTrc99e ；
5)将构建重组质粒pTrC99e导入缺乏乳酸脱氢酶基因(7 /Μ)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/73)活性的出发菌的感受态，获得的阳性转化子即为产丁醇基因工程菌。二、采用本发明所述的构建方法得到的一株产丁醇基因工程菌菌株，其分类命名为大肠杆菌co7i) LP_99e，其保藏号编号为CCTCC NO M 2011403。三、本发明所述产丁醇基因工程菌的应用，包括菌种活化、种子培养、发酵培养产丁醇三步骤。(I)菌种活化划线保藏的产丁醇基因工程菌的菌液到含有氯霉素和氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管；
(2)种子培养按照体积比1%的接种量接入种子培养基中，有氧培养菌体OD6tltl至
O.8-1. O 时用 O. 3mM 的 IPTG 诱导至 OD600=3 ；
(3)发酵培养产丁醇按接种量体积比10%转接至发酵培养基中厌氧发酵；其中，发酵培养基为LB,葡萄糖15 g/L,卡那霉素30 μ g/mL,氨节青霉素50 μ g/mL,氯霉素25 μ g/mL,0. 3mM IPTG。本发明的有益效果在于
采用基因工程手段将克氏梭菌丁醇合成途径中关键基因cat I、sucDAhbd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌中的基因bcd-etfB-etfA、ad成在大肠杆菌中进行重组表达，使重组大肠杆菌能够产丁醇及其生产丁醇的方法未见公开，此应用推动了基因工程菌产丁醇的发展。目前利用大肠杆菌工程菌生产丁醇的产量虽然不高，但这为产丙酮丁醇大肠杆菌的基因工程研究奠定了良好的基础。在大肠杆菌中构建新的丁醇生产系统，作为一种新型生产丁醇的途径，必将成为今后研究高产丁醇的发展方向之一。
图I构建的产丁醇基因工程菌中丁醇代谢途径图。图2中间重组质粒pTrcCKL-5构建图谱。图3中间重组质粒T-A构建图谱。图4中间重组质粒T-A-B构建图谱。
图5重组质粒重组质粒pTrc99e的构建图谱。图6中间重组质粒pTrcCKL-5的&oR V单酶切鉴定图。图7重组质粒pTrc99e的Sma\单酶切鉴定图。图8重组质粒pTrc99e的Kpnl单酶切鉴定图。本发明的产丁醇基因工程菌菌株，其分类命名为大肠杆菌(fccAericAia coli)LP-99e ;其保藏机构全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址为中国.武汉.武汉大学；保藏日期为2011年11月21日，保藏号编号为CCTCC NO M 2011403。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明的生物材料的来源的说明
I、质粒来源
(I) pTrc99a :购自 Introvegen 公司；
(2 ) pGEM-T Easy:购自 Promega 公司。2、基因组模板来源
(1)克氏梭菌基因组DNA C. kluyveri DSM 555 购自 DSMZ ；
(2)丙酮丁醇梭菌基因组DNA C. acetobutylicum ATCC 824 购买自 ATCC。3、出发菌株'E. colik￥ Ul的感受态菌株的来源有两处
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
(2)该生物材料还在中国专利(申请号96198547.X，申请日1996. 10. 31，授权曰2003年I月I日，授权公告号CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。4、引物的设计及合成自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。实施例I
本实施例说明构建包含表达基因cat I、sucD、^hbd、cat2、abfd的中间质粒pTrcCKL_5。其过程包括
I、设计合成带有AfcoI酶切位点的上游引物和带有式 I酶切位点的下游引物， Primerl 上游引物5’ -ACGT CCATGGATGAGTAAAGGGATAAAG-3’ ；
Primer2 下游引物5’ -ACGTGGTACCATAAAGTGTAACTAAAAATCA-3’。2、以克氏梭菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为95°C，
10min ；(95°C 30 s，50°C 30 s，72°C 8min，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的trc—ca tl-sucD-Ahbd-ca t2~abfd 基因后，表达质粒 pTrc99a 分别用 Nco I 和 Kpn I 双酶切、连接获得重组质粒pTrcCKL-5。使用V单酶切鉴定重组质粒pTrcCKL_5，得到四条带大小分别是5805bp、和4163bp、881 bp和514 bp，结果见图6，酶切结果表明，重组质粒pTrcCKL-5构建成功。 特别说明针对实施例I所述的cat I、sucD.、4hbd、cat 2 ^ abfd这5个基因片段,本发明采用了同一引物，可以分别克隆该5个基因片段后，分别插入到表达质粒pTrc99a相应的酶切位点之间，获得重组质粒pTrcCKL-5 ;也可以一次性克隆出该5个基因片段，一次性插入到表达质粒pTrc99a相应的酶切位点之间，获得重组质粒pTrcCKL-5。实施例2
本实施例说明构建包含表达基因bcd-etfB-etfA、adhe的中间重组质粒T_A_B。其过程包括
I、包含基因adhe的中间质粒T-A的构建，
(I)合成带有I酶切位点的上游引物和不带酶切位点的下游引物
Primer3上游引物
5’ -ATCGCCCGGGTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACACCATGGATGAAAGTTACAAATCAAAA-3，；
Primer4下游引物
5’ -AGCTTTAAAATGATTTTATATAGAT-3’。(2)以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为95°C, 10 min ； (95°C 30 s，48°C 30 s，72°C 3min，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的trc-H基因后,表达质粒pGEM-T Easy与trc-H片段连接获得中间重组质粒T-A。2、包含基因adhe、bcd_etfB_etfA的中间质粒T-A-B的构建，
(I)合成带有feci酶切位点的上游引物和带有feci和Sim I酶切位点酶切位点的下游引物
Primer5 上游引物5’ -ATCGGAGCTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAAGATCTATGGAT TTTAATTTAACAAG-3’ ；
Primer6下游引物
5，-AGCTGAGCTCCCCGGGTTAATTATTAGCAGCTTTAA-3，。(2)以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因片段，反应条件为95°C, 10 min ； (95°C 30 s，48°C 30 s，72°C 3min，30 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的trc-bcd-etfB-etfA基因后，中间质粒T-A用SacI酶切、连接获得新的中间重组质粒T-A-B。实施例3
本实施例说明构建重组表达基因ca 7、sucD、Ahbd^ ca t2、abfd、bcd~e tfB~e tfA、acim的最终重组质粒pTrc99e，即在中间重组质粒pTrcCKL-5基础上连接基因ai*E、bcd-etfB-etfA,得到最终重组质粒pTrc99e。I、构建重组表达基因 cat I、sucD、^hbd、cat2、abfd.、bcd~e tfB~e tfA > adti^L 的最终重组质粒pTrc99e,其过程包括
以中间重组质粒T-A-B为模板，PCR扩增目的基因片段(以前述Primer3和Primer6为上下游引物)，反应条件为95°C，10 min ； (95°C 30 s，48°C 30 s，72°C 6min，35 个循环)；72°C，10 min。纯化扩增出的 trc-adhl-bcd-etfB-etfA 基因后，将中间质粒 pTrc99CKL_5用Smal酶切、连接获得最终重组质粒pTrc99e。使用Smal和治ml分别单酶切鉴定重组质粒pTrc99e，5k3l切得到两条大小分别是11313bp和5800bp的条带，结果见图7 -,Kpnl酶切得到三条大小分别是13914bp、1878bp和1358bp的条带，结果见图8，酶切结果表明，重组质粒pTrc99e构建成功。
2、将质粒pTrc99e导入出发菌株疋coliAFPlll的感受态(即缺乏乳酸脱氢酶基因(A/M)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/73)活性的菌株)，获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株 coli LP_99e。需要特别说明的是，本发明实施例1-3所述的七个基因片段(其中bcd-etfB-etfA视为一个基因片段)是在基因组上相连的大概长度在8000多bp的长片段，因此实施例3得到的重组质粒pTrC99e可视为一个总的长基因片段。
实施例4
本实施例说明过量表达新构建的大肠杆菌LP-99e与出发菌株疋co7iAFPlll两者发酵过程中产丁醇能力的对比。(I)菌种活化划线_80°C冻存管保藏的大肠杆菌LP_99e的菌液到含有氯霉素和氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到5mL LB培养基的试管。其中，所述的含有氯霉素和氨苄青霉素的平板的配方为LB+Amp(氨苄青霉素50 μ g/mL) +Chl (氯霉素 25 μ g/mL) +15% 琼脂。(2)种子培养按照体积比1%的接种量接入种子培养基中，有氧培养菌体OD6tltl至O. 8-1. O左右时用O. 3mM的IPTG诱导至OD600=3左右。所述的种子培养基的配方为酵母粉3 g/L，蛋白胨5 g/L，可溶性淀粉10 g/L，乙酸铵 2 g/L, NaCl 2 g/L，MgSO4 3 g/L，KH2PO4 I g/L, K2HPO4 I g/L，FeSO4 · 7H20 0.1 g/L,固体加琼脂20 g/L，pH6.0。(3)发酵培养产丁醇采用厌氧血清瓶发酵，按接种量体积比10%转接至发酵培养基中厌氧发酵48 h。厌氧血清瓶用发酵培养基为LB+葡萄糖(15g/L) +Kan (卡那霉素30 μ g/mL) +Amp (氨苄青霉素 50 μ g/mL) +Chl (氯霉素 25 μ g/mL) +0. 3mM IPTG。厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表I。
权利要求
1.一种产丁醇基因工程菌的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株为出发菌株，重组表达基因caU、sucDMd, cat2、abfd、 bcd-e tfB-e tfA、，获得产丁醇基因工程菌。
2.根据权利要求I所述的产丁醇基因工程菌的构建方法，其特征在于具体步骤如下1)以克氏梭菌基因组DNA为模板，分别纯化扩增出catI、sucD、Ahbd、cat2、abfd基M， 插入到表达质粒pTrc99a相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒pTrcCKL_5 ；2)以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出基因后，插入到表达质粒 pGEM-T Easy相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A ；3)以丙酮丁醇梭菌基因组DNA为模板，纯化扩增出基因后，插入到中间重组质粒T-A相应的酶切位点之间、连接获得中间重组质粒T-A-B ；4)以中间重组质粒T-A-B为模板，纯化扩增出的trc-acim-bcd-etfB-etfA基因后，插入中间质粒pTrc99CKL-5相应的酶切位点之间、连接获得最终重组质粒pTrc99e ；5)将构建重组质粒pTrC99e导入缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的出发菌的感受态，获得的阳性转化子即为产丁醇基因工程菌。
3.采用权利要求I所述的构建方法得到的一株产丁醇基因工程菌菌株，其分类命名为大肠杆菌co7i) LP_99e，其保藏号编号为CCTCC NO M 2011403。
4.权利要求I所述产丁醇基因工程菌的应用，其特征在于包括菌种活化、种子培养、 发酵培养产丁醇三步骤，(1)菌种活化划线保藏的产丁醇基因工程菌的菌液到含有氯霉素和氨苄青霉素的平板，挑取平板上长出的单菌落到LB培养基的试管；(2)种子培养按照体积比1%的接种量接入种子培养基中，有氧培养菌体OD6tltl至0.8-1. 0 时用 0. 3mM 的 IPTG 诱导至 OD600=3 ；(3)发酵培养产丁醇按接种量体积比10%转接至发酵培养基中厌氧发酵；其中，发酵培养基为LB,葡萄糖15 g/L,卡那霉素30 V- g/mL,氨节青霉素50 u g/mL,氯霉素25 u g/ mL,0. 3mM IPTG。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及产丁醇基因工程菌的构建、菌株及其应用。其构建过程主要通过分子生物学手段将克氏梭菌丁醇合成途径中关键基因cat1、sucD、4hbd、cat2、abfD和丙酮丁醇梭菌中的基因bcd-etfB-etfA、adhE在大肠杆菌中进行重组表达，构建出从丁二酸到丁醇的代谢通路。利用已构建的重组菌株EscherichiacoliLP-99e进行发酵使其能够生产丁醇。
文档编号C12R1/19GK102618569SQ20121006792
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者姜岷, 张秋妍, 欧阳平凯, 郭亭, 陈佳楠, 韦萍 申请人:南京工业大学