专利名称：Ha-vp2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。
背景技术：
传染性法氏囊病是危害世界养禽业的主要传染病之一。目前，对于传染性法氏囊病的防治仍是以传统疫苗为主，但是由于病毒抗原的不断变异，特别是超强毒株的出现，使得此病的防控形势更加严峻，而且现存的杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低。因此，研制新型、高效的基因工程疫苗来解决传统疫苗防治的弊端显得尤为重要。研究认为VP2蛋白是传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白，也是宿主的保护性抗原。应用改进的重组杆状病毒表达系统在哺乳动物细胞中表达VP2抗原蛋白是新型禽类基因工程疫苗研制的关键性问题。
发明内容
本发明是要解决目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题，提供HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行一、以质粒pMD18-T-VP2为模板，TZF-1和TZF-2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒PTZF-HA-VP2 ；二、质粒 pWK、pWK-I、pLM、pLM_I、pSD、pSD_I、pWKC、pLMC、pSDC 和 pTZF-HA_VP2分别进行EcoR I/Sal I双酶切，酶切后获得的目的片段pWK、pWK_I、pLM、pLM_I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC分别与酶切后的pTZF-HA_VP2用T4DNA连接酶进行连接，九种连接产物经鉴定后获得九种重组转移载体，分别为PTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA_VP2、PTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA_VP2、pTZF-SD_HA_VP2、pTZF_SD-I-HA_VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2 和 pTZF-SDC-HA_VP2 ；三、将九种重组转移载体分别转化E. coli DHlO Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X ；四、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X转染af9细胞，获得九种重组杆状病毒 rBV-TZF-X，分别为 rBV-TZF_WK_HVP2、rBV_TZF-WK-I_HVP2、rBV-TZF-LM-HVP2、rBV_TZF-LM-I_HVP2、rBV-TZF_SD_HVP2、rBV_TZF-SD-I_HVP2、rBV-TZF-WKC-HVP2、rBV-TZF-LMC-HVP2 和 rBV-TZF_SDC_HVP2，即完成 HA-VP2 基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物TZF-I 序列为 5，-CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’ ；引物 TZF-2 序列为 5’ CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT-3’。本发明通过构建了重组转移载体PTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA_VP2、PTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA_VP2、pTZF-SD_HA_VP2、pTZF_SD-I-HA_VP2、PTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA_VP2 和 pTZF-SDC-HA_VP2，融合蛋白 HA-VP2 可在其内成功 表达，且具有抗原性；这为进一步开发以本发明改造的杆状病毒转移载体为基础的基因工程疫苗奠定了基础。本发明还证实了添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率，从而确定了重杆状病毒表达载体表达HA-VP2蛋白的强度。
图I为具体实施方式
一中SDS-PAGE鉴定HA-VP2蛋白的表达的电泳图，其中泳道
1、2、3、4、5和6为经重组杆状病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆虫细胞裂解物，泳道7为未经病毒侵染的细胞对照裂解物；图2为具体实施方式
一中SDS-PAGE鉴定HA-VP2蛋白的表达的电泳图，其中泳道
8、9和10为经重组杆状病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆虫细胞裂解物,泳道11为未经病毒侵染的细胞对照裂解物；图3为具体实施方式
一中HA-VP2蛋白的Western blotting检测的电泳图，其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8和9为重组杆状病毒rBV-TZF-X侵染sf9昆虫细胞裂解的产物。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法,按以下步骤进行一、以质粒pMD18-T-VP2为模板，TZF-1和TZF-2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒PTZF-HA-VP2 ；二、质粒 pWK、pWK-I、pLM、pLM_I、pSD、pSD_I、pWKC、pLMC、pSDC 和 pTZF-HA_VP2分别进行EcoR I/Sal I双酶切，酶切后获得的目的片段pWK、pWK_I、pLM、pLM_I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC分别与酶切后的pTZF-HA_VP2用T4DNA连接酶进行连接，九种连接产物经鉴定后获得九种重组转移载体，分别为PTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA_VP2、PTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM_I-HA_VP2、pTZF-SD_HA_VP2、pTZF_SD_I-HA-VP2、pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA-VP2 和 pTZF-SDC-HA_VP2 ；三、将九种重组转移载体分别转化E. coli DHlO Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA，统称为重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X ；四、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X转染sf9细胞，获得九种重组杆状病毒 rBV-TZF-X，分别为 rBV-TZF_WK_HVP2、rBV_TZF-WK-I_HVP2、rBV-TZF-LM-HVP2、rBV_TZF-LM-I_HVP2、rBV-TZF_SD_HVP2、rBV_TZF-SD-I_HVP2、rBV-TZF-WKC-HVP2、rBV-TZF-LMC-HVP2 和 rBV-TZF_SDC_HVP2，即完成 HA-VP2 基因重组杆状病毒表达载体的构建；其中步骤一中引物TZF-I 序列为 5，-CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’ ；引物 TZF-2 序列为 5’ CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT-3’。本实施方式所述质粒pMD18-T-VP2购自大连宝生物工程有限公司；所述质粒pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC 均购自 Invitrogen 公司；本实施方式在具体操作中涉及使用的各种反应试剂或试剂盒均为购买得到(大连宝生物工程有限公司)，并按说明书操作。本实施方式步骤一中目的片段的TA克隆(即加“A”反应)目的片段的TA克隆反应体系为 25ii L，由 2. L IOXTaq Buffer,2u L 2. 5mM 的 dNTP Mixture、20 y L胶回收 产物和0. 5 ii L 5U/ ii L的Taq DNA聚合酶组成，72°C反应15分钟，获得目的片段TA克隆产物。本实施方式步骤一中所得产物再与pMD18-T载体连接连接反应体系为5 y L，由0. 5u L pMD18-T载体、2iiL目的片段TA克隆产物和2. 5iiL Solution I组成，16°C条件下连接过夜，获得质粒PTZF-HA-VP2 ;其中Solution I为pMD18_T载体配套缓冲液，内含T4DNA连接酶。本实施方式步骤一中连接产物经鉴定后获得质粒pTZF-HA-VP2 :连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞；经蓝白斑筛选，以碱裂解法小量制备质粒DNA，置_20°C保存备用；并对质粒DNA进行菌液PCR鉴定和EcoR I与Sal I双酶切鉴定；将筛选出的阳性重组质粒送交北京英俊生物公司测序,测序引物为PMD18-T载体测序通用引物；将测序结果利用DNAStar生物学软件与原始序列进行比对分析，确定重组子序列无突变，最终命名为pTZF-HA-VP20本实施方式步骤二中连接产物的鉴定连接产物转化E. coli DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组子，以碱裂解法小量制备质粒DNA，置-20°C保存备用；并用以下三种酶切进行质粒DNA的鉴定即Pst I单酶切用以鉴定质粒中所含有的ITRs元件；EcoR I/SalI双酶切用以鉴定重组质粒中所连接的HA-VP2片段；EcoR I/Xba I双酶切用以鉴定质粒中含有的EFl a启动子；酶切反应为在37°C条件下作用2h ;将连接后获得的阳性重组质粒命名为 pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA_VP2。本实施方式步骤二中连接产物的鉴定连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组子，以碱裂解法小量制备质粒DNA，置_20°C保存备用；EcoR I/XbaI双酶切用以鉴定CMV启动子，将连接后获得的阳性重组质粒命名为pTZF-LM-HA-VP2、pTZF-LM-I-HA-VP20本实施方式步骤二中连接产物的鉴定连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组子，以碱裂解法小量制备质粒DNA，置_20°C保存备用；EcoR I/XbaI双酶切用以鉴定CBA启动子，将连接后获得的阳性重组质粒命名为pTZF-SD-HA-VP2、pTZF-SD-I-HA-VP20本实施方式步骤二中连接产物的鉴定连接产物转化至E. coli DH5a感受态细胞，经蓝白斑筛选重组子，以碱裂解法小量制备质粒DNA，置-20°C保存备用；由于对照载体中不含有HRs，所以仅用EcoR I/Sal I双酶切和EcoR I/Xba I双酶切分别对每一类重组子进行鉴定；将获得的阳性重组对照质粒分别命名为pTZF-WKC-HA-VP2、pTZF-LMC-HA_VP2、pTZF-SDC-HA-VP20本实施方式步骤三中提取九种重组Bacmid DNA的步骤(I)挑取白色单克隆于3mL LB液体培养基(额外添加50 u g/mL卡那霉素、7 y g/mL庆大霉素、10 u g/mL四环素)，37°C，250-300r/min条件下振荡培养24h以上；(2)将I. 5mL细菌培养液转移到I. 5mL离心管，13000r/min离心lmin,弃上清,沉淀重悬于0. 3mL预冷的Bacmid DNA提取溶液I中，振荡以分散沉淀；(3)加入0. 3mL新鲜配制的溶液II，混匀，室温静置5min ；(4)加入0.3mL溶液III，混匀，当蛋白质与E. coli基因组DNA形成浓厚的白色沉淀时，冰浴静置5-10min;(5) 14000g室温离心IOmin,期间另取2mL离心管,加入800 ii L异丙醇；(6)将上清液转入含异丙醇的离心管，不要将白色沉淀加进去，倒转离心管数次混匀液体，冰上放置5-10min ；(7) 13000r/min室温离心15min，移弃上清，沉淀用0. 5mL预冷75%乙醇洗涤I次，13000r/min 室温离心 5min ；(8)弃上清，沉淀置于室温IOmin自然干燥；(9)加入40 ii L无菌ddH20溶解沉淀，于4°C短期保存备用。以IOOng 重组 Bacmid DNA 为模板，以 M13-47/TZF-1 和 TZF-1/TZF-2 分别为引物，对分离提取的重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X进行PCR鉴定。本实施方式步骤四中利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X转染sf9细胞的步骤(I)取生长状态良好的sf9细胞，800r/min离心5min ；(2)弃去上清液，用新鲜的sf900II完全生长培养液重悬细胞沉淀，调整细胞密度至4. 5 X IO5个/mL，以每孔2mL接于6孔细胞培养板内，细胞贴壁培养Ih后进行转染实验；(3)弃去sf9细胞的培养液，用2mL sf900II SFM培养液洗涤细胞，弃去洗涤培养液，重复操作两次；(4)向含有DNA-脂质体混合物的每个小清瓶内加入0. 8mL sf900II SFM培养液，温和混匀后分别加至6孔板的每个细胞培养孔中，其中有一个孔只含有转染试剂而不含有Bacmid DNA (rBac-TZF-X)作为对照孔，27°C培养 5h ;(5)吸出DNA-脂质体混合物，向每个细胞孔中加入2mL sf900II完全生长培养液，27°C条件下培养至细胞出现明显病变效应。表达效果验证试验一、Pl代(第一代)重组杆状病毒rBV-TZF-X的收获与滴度测定(I)当Sf9细胞出现感染迹象时，将上层培养液(约2mL)转移到无菌带盖的IOmL离心管中，800r/min离心5min以去除细胞及细胞碎片； (2)将含重组杆状病毒的上清液转移到另一个无菌带盖的IOmL离心管中，此时的病毒为Pl病毒储备；(3)将得到的病毒液体避光短期置于4°C冰箱；
(4)采用空斑分析法进行病毒滴度测定。
二、P2、P3代重组杆状病毒rBV-TZF-X的扩增与滴度测定选取处于对数生长期的sf9细胞，调整细胞密度至5 X IO5个细胞/mL，在50mL三角瓶内加入IOmL细胞液，27°C,70r/min培养至细胞密度为5X IO6 ;将Pl代病毒以MOI =
0.07接种于上述培养的细胞内，27°C，70r/min培养72h，收获并保存含病毒的上清液即获得病毒P2储备，测定P2代病毒的滴度；继续扩增重组杆状病毒rBV-TZF-X至P3代，测病毒滴度使其达到2X 108pfu/mL-3X 108pfu/mL为止。三、重组杆状病毒rBV-TZF-X介导的HA-VP2基因在CHO细胞中的表达(I)将传代培养的CHO-Kl细胞经胰酶消化并稀释，以I X IO6个细胞/孔的密度接种于6孔板内，37°C，5% CO2培养箱中培养至细胞铺满单层；(2)向培养液中加入感染复数MOI为100的高滴度的P3代重组杆状病毒液rBV-TZF-X，并向含有病毒的培养液内添加丁酸钠(终浓度为IOmM)，开始病毒侵染，37°C，5% CO2培养箱内侵染12h ；(3)弃掉病毒液，向每孔内加入2mL DMEM完全生长培养基，37°C培养48h ；(4)弃去6孔板内的细胞培养液，用预冷的PBS漂洗细胞两次；(5)将6孔板放置于冰上，每孔内加入200 U L的细胞裂解液，轻轻摇动细胞培养板，使裂解液与细胞充分接触，用细胞刮刀将细胞刮下，吸取裂解物于1.5mL离心管内，收获重组HA-VP2蛋白，分装后-20 V短期保存。四、重组 HA-VP2 蛋白的 SDS-PAGE 及 Western-blotting 鉴定用以下分离胶和浓缩胶对表达的重组HA-VP2蛋白进行SDS-PAGE鉴定。分离胶的制备12%分离胶(IOmL)配方如下表I :
权利要求
1.HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，按以下步骤进行 一、以质粒pMD18-T-VP2为模板，TZF-I和TZF-2为引物，进行PCR扩增，对PCR产物进行I %琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，然后进行目的片段的TA克隆，所得产物再与pMD18-T载体连接，连接产物经鉴定后获得质粒PTZF-HA-VP2 ；二、质粒pWK、pffK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD_I、pWKC、pLMC、pSDC 和 pTZF_HA_VP2 分别进行 EcoR I/Sal I 双酶切，酶切后获得的目的片段 pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、pSDC分别与酶切后的pTZF-HA-VP2用T4DNA连接酶进行连接，九种连接产物经鉴定后获得九种重组转移载体，分别为 pTZF-WK-HA-VP2、pTZF-WK-I-HA_VP2、pTZF-LM-HA_VP2、PTZF-LM-I-HA-VP2、pTZF-SD_HA_VP2、pTZF-SD-I-HA_VP2、pTZF_WKC-HA_VP2、PTZF-LMC-HA-VP2 和 pTZF-SDC-HA_VP2 ； 三、将九种重组转移载体分别转化E.coli DHlO Bac感受态细胞，经蓝白筛选后挑取白色单菌落，然后提取九种重组Bacmid DNA,统称为重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF_X ； 四、利用脂质体介导转染法将重组杆状病毒穿梭质粒rBac-TZF-X转染sf9细胞，获得九种重组杆状病毒 rBV-TZF-X，分别为 rBV-TZF_WK_HVP2、rBV_TZF-WK-I_HVP2、rBV-TZF-LM-HVP2、rBV_TZF-LM-I_HVP2、rBV-TZF_SD_HVP2、rBV_TZF-SD-I_HVP2、rBV-TZF-WKC-HVP2、rBV-TZF-LMC-HVP2 和 rBV-TZF_SDC_HVP2，即完成 HA-VP2 基因重组杆状病毒表达载体的构建； 其中步骤一中引物 TZF-I 序列为 5，-CCGGAATTCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC-3’ ；引物 TZF-2 序列为 5’ CGCGTCGACTTACCTTATGGCCCGGATTATGTCTTT-3，。
2.根据权利要求I所述的HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中PCR扩增的反应体系为50 ii L反应体系，由下列成分组成 成分用量0.2pmol/|iL 质粒 pMD18-T-VP2 4|iL 10|iM 引物 TZF-II|iL 10|iM 引物 TZF-2l|iL 2 X PrimerSTAR GC Buffer 25|iL2.5mM I X dNTP Mixture4|iL5U/|iL PrimerSTAR DNA 聚合酶 0.5|iL 无菌水余量 PCR扩增条件为:98°〇变性41^11，981变性10s，55°C退火5s，72°C延伸lmin，共30个循环，再72°C延伸5min,4°C保温。
3.根据权利要求I所述的HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中目的片段的TA克隆的反应体系为25 u L，由下列成分组成成分用量 IOxTaq Buffer2.5|iL.2.5mM 的 dNTP Mixture2|iL 胶回收产物20|iL5U/|iL 的 Taq DNA 聚合酶0.5 无菌水余量 目的片段的TA克隆条件为72°C反应15分钟。
4.根据权利要求I所述的HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤一中连接的体系为5 u L，由下列成分组成 成分用量 目的片段TA克隆产物 2|iL pMD18-T 载体0.5|iL Solution I2.5|iL 连接反应条件为16°C连接过夜。
5.根据权利要求I所述的HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤二中质粒 pWK、pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、pSD_I、pWKC、pLMC、pSDC 分别进行双酶切的体系如下 成分用量 质粒 pWK、pWK-I、lpLM、pLM-I、pSD、pSD-I、pWKC、pLMC、 pSDC Sail2.5|iL EcoBJ2.5|iL IOxMBuffer5|iL 无菌水30|iL 酶切反应条件为37°C水浴2h。
6.根据权利要求I所述的HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤二中pTZF-HA-VP2双酶切的体系如下成分用量 pTZF-HA-VP2 5|iLSail2.5|iLEcoBJ2.5|iL IOxMBuffer 5|iL无菌水35|iL 酶切反应条件为37°C水浴2h。
7.根据权利要求I所述的HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，其特征在于步骤三中连接的体系如下 成分用量酶切后的 pTZF-HA-VP23 |iL 酶切后获得的目的片段pWK、 pWK-I、pLM、pLM-I、pSD、5|iL pSD-I、pWKC、pLMC、pSDCIOXLigation BufferI|iL T4 DNA 连接酶0.4|iL 无菌水0.6|iL 连接反应条件为16°C连接过夜。
全文摘要
HA-VP2基因重组杆状病毒表达载体的构建方法，涉及基因重组杆状病毒表达载体的构建方法。它解决了目前杆状病毒介导的外源基因在CHO细胞中的表达率较低的问题。方法一、以pMD18-T-VP2为模板进行PCR扩增，获得目的片段进行TA克隆及载体连接，得pTZF-HA-VP2；二、九种质粒和pTZF-HA-VP2分别进行双酶切，酶切后的目的片段进行连接，得九种重组转移载体；三、九种重组转移载体分别转化感受态细胞，经提取后得rBac-TZF-X；四、rBac-TZF-X转染sf9细胞，得rBV-TZF-X即完成。本发明添加调控元件WPRE可以提高杆状病毒介导外源基因在CHO细胞中的表达率。
文档编号C12N15/866GK102618579SQ20121009304
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者凌宏志, 唐晓艳, 安琪, 宋刚, 平文祥, 楼庄伟, 田兆峰, 葛菁萍, 金丽颖, 高冬妮 申请人:黑龙江大学