一种单取代烷基化化合物的方法
【专利摘要】一种单取代烷基化化合物的方法，提供使用醛亚胺型希夫碱制造特定式所表示的α-氨基酸的不对称单取代烷基化化合物的方法。本发明的方法中，在介质中、在光学活性的季铵盐类相转移催化剂和无机碱的存在下，开始将醛亚胺型希夫碱烷基化的步骤，然后在该烷基化反应的化学计量反应结束时间前的时间进行猝灭，由此可以得到光学纯度高的单取代烷基化物。
【专利说明】一种单取代烷基化化合物的方法
[0001]发明技术
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种单取代烷基化化合物的方法。
[0002]发明背景
单取代烷基化化合物，在生物和非生物样本的分析检测已经成为常规的临床实践和分析实验室。这些检测技术可以分为两大类:(I)根据配体-受体的相互作用(例如，免疫测定法为基础的技术)和(2)基于核酸杂交(多核苷酸序列为基础的技术)。
[0003]免疫测定法为基础的技术，其特征在于由一个序列的步骤包括非共价结合的抗体，该抗体和抗原互补。多核苷酸序列为基础的检测技术，其特征在于，由一个序列的步骤包括非共价结合的标记的多核苷酸序列或探针的被分析物的互补序列，允许杂交的碱的条件下，通过沃森-克里克配对该杂交检测。
[0004]非共价结合的标记的序列的核酸探针的互补序列的多核苷酸序列为基础的检测技术是主要的识别事件。这种绑定事件所带来的精确的分子排列和互动互补的核苷酸探针和目标。它是由非共价键合的自由能，例如，氢键，堆叠自由能和释放的能量优势。
【发明内容】
[0005]为了采用用于测定含有靶序列的核酸探针的非共价结合，它是必要的，以便能够结合的探针检测到目标。这种检测是通过信令步骤或事件的影响。信令步骤或事件使一些定性或定量的方式检测的主要识别事件的发生。
[0006]也可以采用各种各样的信号事件检测到的主要的识别事件的发生。信号事件的选择取决于所采用的报告分子的特征的特定的信号。虽然标记试剂本身，无需进一步处理，可能会检测到，更多的时候，无论是报道分子共价连接，或结合的非共价结合到标记试剂。
[0007]有用的多核苷酸序列作为探针在核酸检测系统中的标记试剂的共价连接，也可以采用各种各样的报告分子。所有需要的是，报道分子提供可能被检测到一个信号，即通过适当的方式，有能力以共价键连接到标记试剂。
[0008]分子可以是放射性或非放射性的。放射性的信令部分，其特征在于由一个或多个放射性同位素的磷，碘，氢，碳，钴，镍等。最好的放射性同位素发出公测。伽玛辐射，并且具有长的半衰期。放射性的报告分子的检测通常是通过由结晶引起的辐射的检测器，或一个照相乳剂的灰雾的刺激光子发射。
[0009]非放射性的报告分子具有的优点在于，它们的使用不会造成与暴露于辐射的危险，并且不要求使用特殊的处理技术。此外，它们通常是更稳定的，并且作为一个结果，更便宜地使用。也许是一样高或更高的比放射性报告分子的非放射性的报告分子的检测灵敏度。
[0010]简单且可靠地与非放射性的检测标记物标记的DNA的能力使得它非常适合于使用在各种各样的分子和细胞生物学的应用。非放射性标记的DNA或RNA探针可用于某些特定的应用，包括杂交反应程序(南，北，槽，或斑点印迹，原位杂交)，核酸定位研究，DNA或RNA的定量和DNA酶或RNA酶定量。
[0011]已经开发了两种酶介导的直接标记协议附加的非放射性检测标记，如荧光化合物的荧光素和若丹明(和其他)的DNA。虽然这些标记方法允许非放射性检测系统的方法或超过放射性测量方法在灵敏度方面仍然存在显着的缺点，迄今已开发的每一个的非放射性标记系统。I)酶促DNA标记系统需要的试剂，包括一些未标记和标记的核苷酸前体，引物，和/或促进DNA合成的酶。标记效率不容易控制和最常见的两种标记反应(切口平移，随机引物)是不可能创建的标记探针作为起始DNA是相同的大小。2)直接标记方法也有明显的局限性，其中包括一个标签导致的敏感性降低，费力多步的标签协议，反应条件苛刻，变异从反应,和不稳定的反应效率较低。
[0012]通常情况下，根据分析的多核苷酸(RNA，DNA)必须首先是按大小分级分离，转移到固体支持物上，然后通过一系列的步骤处理，以确保只有特异性结合的探针。检测杂交产品通常取决于単，重金属的衍生或抗体络合。杂交的方法一直是主食的基础研究，现在还担任商业试剂盒，用于诊断遗传，恶性传染病的数量不断增加。
[0013]理想的标记方法将结合一个步骤的简单性与高效率标识，在保持完整的，稳定的和相同尺寸的起始的DNA的标记产物的结果。为了开发与这些特征，我们用氮芥具有的能力，以在一个步骤中的反应得到的含有共价键连接的加合物的DNA烷基化DNA标记试剂。
[0014]间化学键形成的化合物与多聚核酸和/或蛋白质中的标记结果的步骤。标记过程包括孵化与所述化合物在水性或非水性溶液，其次是与未反应的标记试剂的标记的多聚核酸的分离的多核酸。标签上的程度可以通过调节标记试剂和多聚核酸的相对量来控制，通过调整培养的长度，通过温育的温度控制，通过控制多聚核酸和标记试剂的绝对浓度，并通过控制的解决方案，使用水或有机溶剂，pH值，离子强度和缓冲液组合物。
[0015]具体实施方法:
标记的多聚核酸可用于多种用途:
I)技术来检测特定序列的多聚核酸，依赖目标的核酸或蛋白，包括斑点印迹，槽印迹，Southern印迹,Northern印迹杂交,西南部,FISH (突光原位杂交或标记的多聚核酸的结合亲和力，杂交)，原位杂交的RNA和DNA序列，新发展上的“芯片”或多孔或多时隙的移动设备在其中的是多聚核酸的组合技术。
[0016]2)标记，以确定它们的亚细胞和组织的位置传递到细胞在体外或体内的多聚核酸。
[0017]3)标记的寡核苷酸被用作引物如PCR扩增技术(聚合酶链式反应)。
[0018]4)聚核酸定量。
[0019]5)定量核酸(核糖核酸酶和DNA酶)，荧光偏振或荧光去猝灭。
[0020]6)聚核酸测序。
[0021]7)直接突变检测。
[0022]8)反应性基团的共价连接，使用反义的应用程序。
[0023]还描述了一种方法官能化的地高辛。地高辛官能团首先在终端上的糖残基形成地高辛二醛氧化二醇的功能，随后的还原性烷基化反应用氰基硼氢化钠和联化合物。链接器包括与伯胺的有机分子和受保护的伯胺，后将地高辛的衍生物与具有伯氨基的保护基团的去除。伯胺可以转化为醛或酮的反应性基团如氨基硫脲或酰肼基的硫醇反应性基团，如卤代乙酰胺，马来酰亚胺，二硫醚，或吡啶基二硫；；胺的反应性基团(如琥珀酰亚胺酯)，异硫氰酸酯，或磺酰氯，或如重氮甲烷或卤代乙酰基的反应性基团的羧酸。此方法的结果，可用于标签的蛋白质，肽，多糖，脂质，和其它感兴趣的分子中地高辛分子。从廉价的前驱物也适合直线前进的合成实用程序，以这种独特的方法，提供高辛标签。
[0024]提供了一个单步标签共价连接的核酸的方法，包括，用于烷基化的核酸形成共价键有可拆卸的标记试剂。然后，结合的共价键有可拆卸的标记试剂的混合物，其中包含的核酸，其特征在于，所述标记试剂的条件下，从而与核酸形成共价键的反应性。
[0025]提供的化合物是标记分子，其含有一个共价键有可拆卸的用于烷基化，化学品在一个单步反应的标记试剂，从而提供了用可检测的报道分子的化学。
[0026]在一个优选的实施方案中，提供的化合物具有以下结构，包括:
式中，D是选自荧光发光化合物，放射性化合物，半抗原，免疫原性分子，化学发光的发光化合物，和蛋白质组成的组中，B被选中的组中的分子具有亲和性的核酸组成的静电相互作用，小沟结合，大沟结合，夹层；选择A的从烷化剂芥末和3元环衍生物组成的组。
[0027]在一个优选的实施方案中，具有通式结构的化合物，其特征在于，一个含有共价键有可拆卸的标记试剂的容器，用于在一个单步反应中烷基化。也随试剂盒提供的使用说明。所用的术语的使用说明，是指切合的试剂中的至少一个的浓度测定方法的具体表现，混合的参数，如试剂和样品的相对量，试剂/样品外加剂的维护时间周期，温度，缓冲液条件等。
[0028]人能够确定是否一个特定的化合物是适合用于本发明的通过比较候选化合物与成功的实施例中所示的化合物。一个合适的烷基化化合物烷基化的目标分子，在一个单步反应。该例子演示的化合物为成功的目标分子的烷基化反应的合适的方法及其制备的。如果一个候选化合物进行至少80 %的效率，在实施例中所述的化合物，该化合物是一个合适的步骤的烷基化化合物。
[0029]根据一个优选实施例的本发明的核酸分子的核苷酸序列，这可能是互补的靶序列的，被转换成通过共价连接报告分子标记化合物。几种化合物描述是有用的报告分子，用于将核酸和蛋白质。在一个优选的实施方案中，适合用于本发明的化合物包括以下三个部分中的一个或多个:
A-烷基化组——电的化学功能，让他们成为轴承亲核基团的化合物共价连接。烷基化试剂包括芥子气(氮芥和硫芥子气)，三元环(氮丙啶，环氧乙烷，cyclopranes,激活的环丙烷，环硫化物)。
[0030]B-垫片——烷基化基团之间的连接和报道分子-间隔基团，包括烷烃，烯烃，酯，醚，丙三醇，酰胺，糖，多糖，杂原子如氧，硫或氮，和/或分子裂解的生理条件下，如一个二硫桥或酶敏感组。间隔件可以带有净正电荷，或者是以下任何一种:小沟结合剂，大沟结合齐?，嵌入基团，或其它DNA结合的蛋白质或肽，如转录因子，从而提供的化合物具有增加亲和力的多聚核酸。间隔件设置，以减轻可能的分子分离的烷基化化合物以及烷基化反应后的核酸的报道分子的干扰。
[0031]C-记者分子——附加的检测为目的的化合物的化学部分。记者分子可以是荧光的，如一个若丹明或flourescein的衍生物。记者分子可以是半抗原，如地高辛，或结合到其它分子如生物素，抗生物素蛋白和抗生蛋白链霉抗生物素蛋白或结合的外源凝集素的寡糖结合的分子，该分子。记者分子可以是蛋白质或酶如碱性磷酸酶。记者分子还可能包含放射性原子如 H.sup.3,C.sup.14,P.sup.32,P.sup.33 S.sup.35 1.sup.125 1.sup。131Tc.sup.99，以及其他放射性元素。
[0032]在另一个优选的实施例中的一些化合物是有用的交联聚核酸和蛋白质的其它化合物，包括报告分子，蛋白质，脂质，多核酸。在一个优选的实施方案中，适合用于本发明的化合物包括以下三个部分中的一个或多个:
A-烷基化组——电的化学功能，让他们成为轴承亲核基团的化合物共价连接。烷基化试剂包括芥子气(氮芥和硫芥子气)，三元环(氮丙啶，环氧乙烷，cyclopranes,激活的环丙烷，环硫化物)。
[0033]B-垫片——烷基化基团之间的连接和报道分子-间隔基团，包括烷烃，烯烃，酯，醚，丙三醇，酰胺，糖，多糖，杂原子如氧，硫或氮，和/或分子裂解的生理条件下，如一个二硫桥或酶敏感组。间隔件可以带有净正电荷，或者是以下任何一种:小沟结合剂，大沟结合齐?，嵌入基团，或其它DNA结合的蛋白质或肽，如转录因子，从而提供的化合物具有增加亲和力的多聚核酸。
[0034]C-反应组——能够进行进一步的化学反应的一种化学物质的功能。反应性基团包括，但不限于烷基化基团，胺，醇，巯基，异硫氰酸酯，异氰酸酯，酰基叠氮化物，N-hydroxysuccinimides, sufonyl氯，醒，环氧化物，碳酸酯，亚氨酸酯，羧酸盐，alkylposphates arylhalides (如二氟二硝基苯)，1doacetamides,马来酰亚胺，氮丙唳的丙烯酰基氯化物flourobenzes, 二硫化物,琥拍酰胺,羧酸,活化的羧酸基团。
[0035]在另一个优选的实施例中，用于标识使用适合使用本发明包括以下三个部分中的一个或多个化合物的多聚核酸的方法:
A-烷基化组——电的化学功能，让他们成为轴承亲核基团的化合物共价连接。烷基化试剂包括芥子气(氮芥和硫芥子气)，三元环(氮丙啶，也被称为环氧化物，cyclopranes,激活环丙烷，环氧乙烷和环硫化物)。
[0036]B-垫片——烷基化基团之间的连接和报道分子-间隔基团，包括烷烃，烯烃，酯，醚，丙三醇，酰胺，糖，多糖，杂原子如氧，硫或氮，和/或分子裂解的生理条件下，如一个二硫桥或酶敏感组。间隔件可以带有净正电荷，或者是以下任何一种:小沟结合剂，大沟结合齐?，嵌入基团，或其它DNA结合的蛋白质或肽，如转录因子，从而提供的化合物具有增加亲和力的多聚核酸。
[0037]C-记者分子-报告分子一附加的检测为目的的化合物的化学部分。记者分子可以是突光的，如一个若丹明或flourescein的衍生物。记者分子可以是半抗原，如地高辛，或结合到其它分子如生物素，抗生物素蛋白和抗生蛋白链霉抗生物素蛋白或结合的外源凝集素的寡糖结合的分子，该分子。记者分子可以是蛋白质或酶如碱性磷酸酶。记者分子还可能包含放射性原子如 H.sup.3, C.sup.14,P.sup.32,P.sup.33 S.sup.35 1.sup.1251.sup。113 Tc.sup.99，以及其他放射性元素。
[0038]大量的核酸序列中的任何一个，也可以采用按照本发明用于检测目标分子作为探针。包括，例如，在RNA和DNA的靶序列，以及各种病毒，类病毒，真菌，寄生虫或细菌感染，遗传性疾病或其他可取的检测目标分子的序列的多核苷酸序列的特征。探针可以是合成的，半合成的或天然来源的。探针分子，包括多核糖核苷酸和脱氧。
[0039]虽然本发明优选的实施方案中使用的核酸的约30个碱基或更长的时间，也可以使用较短的核酸，只要是能够具体地，稳定地杂交的靶序列。可以被设计的核酸杂交，无论正义或反义链的DNA双链。然而，当目标是信使RNA，探针的序列应该是它的补充。
【权利要求】
1.一种单取代烷基化化合物的方法，包括:a)形成一个共价键有可拆卸的标记试剂，选自选自芥末，和氮丙啶，用于烷基化的核酸； b)将共价键有可拆卸的标记试剂的混合物，其中包含的核酸，其特征在于，所述标记试剂的条件下，具有非特异性的序列与核酸在一段时间内的时间最多一小时，从而形成共价键的反应性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的共价键有可拆卸的标记试剂包括具有报道分子的烷基化化合物。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述烷基化剂是选自芥末和氮丙啶组成的组中。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，芥末选自选自氮芥和硫芥子气。
5.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述报道分子包括从荧光发光分子，含半抗原分子，蛋白质，放射性化学物质组成的组中选择的分子。
6.根据权利要求2的方法，其特征在于，所述报道分子是可连接到烷基化的化合物与间隔臂。
7.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，连接臂是阳离子。
【文档编号】C12Q1/68GK104513817SQ201310453942
【公开日】2015年4月15日 申请日期:2013年9月29日 优先权日:2013年9月29日
【发明者】王阿慧 申请人:上海满益科技有限公司