本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种发酵法制备畜禽血液蛋白肽的方法。
背景技术：
随着我国养殖业和屠宰业的迅速发展，畜禽血液是畜禽加工过程中的重要副产品之一，每年产量达到数百万吨。畜禽血液营养丰富，富含蛋白质、维生素等多种营养物质，如果处理不当极易腐败变质，一方面造成资源浪费，一方面又会产生严重的环境污染问题。将畜禽血液加工成全血蛋白粉、血浆蛋白粉、血球蛋白粉是目前大量处理畜禽血液的重要处理方法，但由于血液易变质，为了控制产品质量，在运输和储藏过程中需要严格低温，存在能源消耗大、生产成本高等问题。如何绿色高效利用畜禽血液生产高附加值产品是目前养殖屠宰业面临的重要问题之一。
通过检索，发现与本专利申请相关的公开文献主要有：
2013年1月9日由中国专利局公告了“一种低灰分的猪血浆蛋白粉的制备方法”，授权公告号为CN 102132760 B，该方法提供了一种血浆蛋白的浓缩和干燥技术，具体涉及一种低灰分的血浆蛋白粉的制备方法。但该发明需要将血浆抽滤冷藏保存，冷藏运输温度为4℃～6℃，耗能大，成本高。
2012年9月19日由中国专利局公告了“一种新型的高品质血浆蛋白粉生产工艺”，申请公布号为CN 102669411 A，该方法提供了一种新型的高品质血浆蛋白粉生产工艺，它包括以下步骤：A、向动物全血内加入抗凝剂和防溶血剂；B、冷藏运输，过筛，离心分离；C、鼓氮脱氧；D、超滤膜连续式脱水除杂浓缩；E、喷雾干燥；F、无菌包装。但该技术同样需要冷藏运输耗能大，成本高。
2012年05月23日由中国专利局公告了“微生物发酵法猪血清蛋白抗氧化肽的方法及其产品”，授权公告号为CN 101608205 B，该发明公开了一种采用微生物发酵法制备猪血清蛋白抗氧化肽的方法及其产品。其制备方法包括以下步骤：(1)将猪血清蛋白进行微滤处理；(2)微滤处理后的猪血清蛋白接种枯草芽孢杆菌菌悬液，发酵；(3)发酵液经离心，取上清液，浓缩，冷冻干燥，即得。本发明制备方法所得到的猪血清蛋白多肽具有较高的抗氧化活性和清除自由基的能力，在体外和体内均有良好的抗氧化作用。该发明为了控制杂菌生长采用微滤方法除菌，虽然可以保证产品质量，但微滤技术生产成本高，易堵塞，难于规模化生产。
庞伟(猪血多肽的发酵法制备及其抑制活性研究，合肥工业大学，硕士论文)报道了枯草芽孢杆菌发酵猪血粉制备猪血多肽，该方法是以猪血粉为原料，需要将猪血先制成猪血粉，与以鲜畜禽血液为原料生产蛋白肽存在本质不同。
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以新鲜畜禽血液为原料，通过发酵法制备畜禽血液蛋白肽的方法，可降低生产过程能耗，且具有抗菌活性，降低抗生素用量。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明发酵采用的微生物为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.Lactis，菌株编号为CGMCC 1.2030、CGMCC 1.2281、CGMCC 1.2829，购自中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。
制备方法包括以下步骤：
(1)菌种制备：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC 1.2030、CGMCC 1.2281、CGMCC 1.2829中的一种或两至三种接种于液体培养基，液体培养基中碳源为0.5-2％的葡萄糖或蔗糖或两种糖的混合物，氮源为0.5-3％的酵母提取物、牛肉膏、蛋白胨中的一种或几种混合物，pH6.5-7.0，30-37℃静置培养12-24h，制得培养好的种子液。
(2)血液抗凝处理：向新鲜畜禽血液中加入0.5-0.8％抗凝剂，抗凝剂主要成分为：柠檬酸钠，六偏磷酸钠、EDTA二钠、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸中的一种或几种混合物，当抗凝剂只有一种成分时只能是柠檬酸钠，六偏磷酸钠、或EDTA二钠中的一种，抗凝剂加入新鲜血液前需要先配制成5-15％的溶液，接血容器需要先用部分抗凝剂喷洒处理，向血液中添加抗凝剂时可以多次泼洒或连续喷淋到血液上，但不宜长时间持续搅拌。
(3)血液发酵：向抗凝处理后的血液中加入2-5％培养好的种子液，发酵容器可为密闭储罐、储槽或运血储罐，无需进行通风搅拌，血液无需冷藏，如果冬季运输或发酵需进行一定保温处理，控制血液温度在20-40℃，血液运输储藏时间根据季节温度不同，时间控制在2-48h制得液体全血蛋白肽。
(4)全血蛋白肽粉制备方法如下：将发酵后液体全血蛋白肽经纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/2-1/5，将浓缩后的全血蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度200-230℃，出风温度70-85℃，制得适度水解的全血蛋白肽粉。
(6)根据终产品种类不同，可将发酵后液体全血蛋白肽进行离心分离，获得血浆蛋白肽和血球蛋白肽，纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/2-1/5，将浓缩后的血浆蛋白肽和血球蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度200-230℃，出风温度70-85℃，获得血浆蛋白肽粉和血球蛋白肽粉。
通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是：采用乳酸乳球菌乳酸亚种发酵新鲜畜禽血液，可以产生一定量乳酸链球菌素，可抑制杂菌污染，从而使新鲜畜禽血液运输储藏过程不必通过低温控制杂菌生长，节省了大量能源；同时通过乳酸乳球菌乳酸亚种发酵新鲜畜禽血液可以将血液中的蛋白质适度水解成短肽，进而提高生物利用率；发酵后的畜禽血液蛋白肽中含有的乳酸链球菌素是一种食品级生物防腐剂，可抑制杂菌生长，因而在将本发明制备血液蛋白肽作为饲料时可有效降低饲料微生物数量，进而减少抗生素的使用量。
具体实施方式
以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例一
一种发酵法制备畜禽血液蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)菌种制备：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC 1.2829菌株接种于液体培养基，液体培养基配方为：葡萄糖0.5％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·H2O 0.005％，CaCO32％，pH6.8，30℃静置培养20-24h，制得培养好的种子液。
(2)血液抗凝处理：向新鲜牛血中加入0.5％抗凝剂，抗凝剂成分为柠檬酸钠，抗凝剂加入新鲜血液前需要先配制成5％的溶液，接血容器需要先用部分抗凝剂喷洒处理，向血液中添加抗凝剂时采用多次泼洒法，得到抗凝处理后的血液。
(3)血液发酵：向抗凝处理后的血液中加入5％培养好的种子液，发酵容器为密闭储罐，无需进行通风搅拌处理，控制血液温度在20-25℃，时间控制在36-48h，得到发酵好的全血蛋白肽。
(4)全血蛋白肽粉制备方法如下：将发酵好的血液蛋白肽经纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/2，将浓缩后的血液蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度200-210℃，出风温度70-75℃，制得适度水解的全血蛋白肽粉，且蛋白肽粉中含有一定量的乳酸链球菌素；蛋白肽粉可用于饲料、生物制剂，生物利用度好，且具有一定抗菌活性，可减少饲料中抗生素的使用量。
实施例二
一种发酵法制备畜禽血液蛋白肽的方法，包括以下步骤：
(1)菌种制备：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC 1.2030或CGMCC 1.2281菌株接种于液体培养基，液体培养基配方为：葡萄糖0.5％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，酪蛋白胨0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，吐温80 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.02％，MnSO4·H3O 0.005％，CaCO3 2％，pH7.0，则30℃静置培养12h，制得培养好的种子液.
(2)血液抗凝处理：向新鲜猪血中加入0.8％抗凝剂，抗凝剂成分为柠檬酸钠，抗凝剂加入新鲜血液前需要先配制成10％的溶液，接血容器需要先用部分抗凝剂喷洒处理，向血液中添加抗凝剂时采用多次泼洒法，得到抗凝处理后的血液。
(3)血液发酵：向抗凝处理后的血液中加入2％培养好的种子液，发酵容器为密闭储罐，无需进行通风搅拌处理，控制血液温度在35-40℃，时间控制在6-8h，得到发酵好的畜禽全血蛋白肽。
(4)全血蛋白肽粉制备方法如下：将发酵好的全血蛋白肽经纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/3，将浓缩后的血液蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度200-210℃，出风温度70-75℃，制得适度水解的全血蛋白肽粉，且蛋白肽粉中含有一定量的乳酸链球菌素；蛋白肽粉可用于饲料、生物制剂，生物利用度好，且具有一定抗菌活性，可减少饲料中抗生素的使用量。
实施例三
(1)菌种制备：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC 1.2030和CGMCC 1.2281混合接种于液体培养基，液体培养基配方为：蔗糖0.5％，牛肉膏1％，酵母提取物0.5％，蛋白胨0.5％，pH6.5，37℃静置培养20-24h，制得培养好的种子液。
(2)血液抗凝处理：向新鲜鸡血中加入0.8％抗凝剂，抗凝剂为柠檬酸钠和六偏磷酸钠混合物，抗凝剂加入新鲜血液前需要先配制成10％的溶液，接血容器需要先用部分抗凝剂喷洒处理，连续喷淋向血液中添加抗凝剂。
(3)血液发酵：向抗凝处理后的血液中加入5％培养好的种子液，发酵容器可为储槽，控制血液温度在35-40℃，时间控制在6-8h，得到液体全血蛋白肽。
(4)全血蛋白肽粉制备：将液体全血蛋白肽经纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/4，将浓缩后的全血蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度220-230℃，出风温度80-85℃；制得适度水解的全血蛋白肽粉，且全血蛋白肽粉末中含有一定量的乳酸链球菌素，具有一定抗菌活性，可减少饲料中抗生素的使用量。
实施例四
(1)菌种制备：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC 1.2030、CGMCC 1.2829和CGMCC 1.2281混合接种于液体培养基，液体培养基配方为：蔗糖2％，酵母提取物3％，pH6.5，37℃静置培养8-12h，制得培养好的种子液。
(2)血液抗凝处理：向新鲜鸭血中加入0.8％抗凝剂，抗凝剂为EDTA二钠，抗凝剂加入新鲜血液前需要先配制成10％的溶液，接血容器需要先用部分抗凝剂喷洒处理，连续喷淋向血液中添加抗凝剂。
(3)血液发酵：向抗凝处理后的血液中加入5％培养好的种子液，发酵容器可为储槽，控制血液温度在35-40℃，时间控制在2-4h，得到全血蛋白肽。
(4)将发酵后的全血蛋白肽室温3000g离心10分钟，获得液体血浆蛋白肽和血球蛋白肽。
(5)血浆蛋白肽粉和血球蛋白肽粉制备方法如下：分别将液体血浆蛋白肽和血球蛋白肽经纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/2，将浓缩后的血浆蛋白肽和血球蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度220-230℃，出风温度80-85℃，制得适度水解的血浆蛋白肽粉和血球蛋白肽粉，且蛋白肽粉末中含有一定量的乳酸链球菌素，具有一定抗菌活性，可减少饲料中抗生素的使用量。
实施例五
(1)菌种制备：将乳酸乳球菌乳酸亚种CGMCC 1.2030、CGMCC 1.2829和CGMCC 1.2281混合接种于液体培养基，液体培养基配方为：蔗糖2％，牛肉膏0.5％，pH6.5，37℃静置培养12-14h，制得培养好的种子液。
(2)血液抗凝处理：向新鲜羊血中加入0.8％抗凝剂，抗凝剂为柠檬酸钠，六偏磷酸钠、EDTA二钠、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸的混合物，抗凝剂加入新鲜血液前需要先配制成15％的溶液，接血容器需要先用部分抗凝剂喷洒处理，连续喷淋向血液中添加抗凝剂。
(3)血液发酵：向抗凝处理后的血液中加入5％培养好的种子液，发酵容器为运血罐车储血罐，血液温度在30-35℃，时间控制在2-3h，得到全血蛋白肽。
(4)将发酵后全血蛋白肽室温4000g离心7分钟，获得血浆蛋白肽和血球蛋白肽。
(5)血浆蛋白肽粉和血球蛋白肽粉制备方法如下：分别将血浆蛋白肽和血球蛋白肽经纳滤浓缩，体积浓缩为原体积的1/5，将浓缩后的血浆蛋白肽和血球蛋白肽采用喷雾干燥法干燥，进风温度220-230℃，出风温度80-85℃，制得适度水解的血浆蛋白肽粉利血球蛋白肽粉，且血浆蛋白肽粉和血球蛋白肽粉中含有一定量的乳酸链球菌素，具有一定抗菌活性，可减少饲料中抗生素的使用量。
采用本发明方法有效克服了新鲜畜禽血液易变质、储运加工过程需控制低温、能耗大的技术难题；并且经乳酸乳球菌发酵后蛋白适度水解提高了利用率，蛋白肽中含有的乳酸链球菌素可抑制杂菌污染，如果用作饲料可降低抗生素用量。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。