一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽、海藻酸钠复合涂膜抑制花生黄曲霉污染的方法与流程

本发明涉及一种较大范围，具体是一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽、海藻酸钠复合涂膜抑制花生黄曲霉污染的方法。

背景技术：

花生又名长生果，也称落花生，我国是世界花生生产和消费最多的国家之一，种植面积仅次于油菜，列第二位，占油料作物种植总面积的四分之一强，在国民经济中占有重要地位。我国花生因品质优良，在国际市场上享有良好的声誉，是世界第一大出口国，花生及其制品年出口量在60-75万吨，创汇7亿多美元，主要销往欧洲、东南亚、日本和中东等120多个国家和地区，占世界花生市场份额的40％，是当前我国粮油类商品中为数不多的在国际上有竞争力的商品之一。

黄曲霉毒素是世界卫生组织(WHO)确认的目前人类已知的最强致癌物，是由黄曲霉菌产生的次级代谢产物，花生因其富含蛋白质和脂肪，因此花生是最容易受黄曲霉菌侵染和黄曲霉毒素污染的作物之一。近几年，由于欧盟、日本等国提高花生黄曲霉毒素等的检测标准，花生安全问题成为制约出口的瓶颈。更为严重的是，我国绝大部分花生在国内消费，严重威胁了国内消费者的健康，这些成为影响我国花生产业长远发展的限制因素。

花生后熟期较长，在花生储藏过程中，因蛋白质、碳水化合物等亲水物质易吸水而发热，更有利于黄曲霉的生长和产毒，我国每年因在储藏环节造成的花生黄曲霉毒素污染造成的产品损失达20％以上，最高甚至达40％以上的浪费。并且黄曲霉毒素性质稳定，极难分解，被污染的人畜不能食用的花生释放到环境中，又对环境造成二次污染。因此，如何在花生储藏环节预防或者控制黄曲霉毒素污染显得尤为紧迫和必要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽、海藻酸钠复合涂膜抑制花生黄曲霉污染的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽、海藻酸钠复合涂膜抑制花生黄曲霉污染的方法，包括以下步骤：

第一步：以解淀粉芽孢杆菌Zn01为菌种，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液；

第二步：取第一步中获得的发酵液400ml，用6mol/L HCL调节至PH＝2.0，4℃静置过夜，利用10000r/min离心20min后沉淀用甲醇溶解、抽滤、滤液经旋转蒸发至干燥，用PBS缓冲液(0.02mol/L，PH7.2)定容至400ml,得抗菌脂肽粗提物，其抗菌效价约为5.0×10⁵IU/L；

第三步：称取40g分析纯海藻酸钠于锥形瓶中，溶于1L去离子水中，加热至完全溶解，以总质量份数0.4％的添加量加入到第二步的抗菌脂肽粗提液中，制备出抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液；

第四步：在具有搅拌功能的密闭容器中，用喷雾装置将抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液均匀喷施于花生表面，复合涂膜液与花生最佳混合比例为20μl/g，在花生表面形成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜，50℃低温烘干或自然晾晒至花生水分10.0％以下，常温保存。

作为本发明进一步的方案：所述第一步中的种子培养的培养基为：胰蛋白胨10.0g/L,葡萄糖2.0g/L，牛心粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钠2.5g/L，PH7.2。

作为本发明进一步的方案：所述第一步中发酵获得发酵液的发酵培养基为：黄豆粉20g/L、玉米淀粉15g/L、葡萄糖3.0g/L、碳酸钙1.5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸亚铁0.6g/L，初始PH7.2，在发酵生产中按体积比5％接种解淀粉芽孢杆菌Zn01，50L发酵罐液体深层发酵48h，发酵工艺参数为：初始PH7.2，温度37℃，转速180r/min,通气量50L/min，罐压0.1Mpa。

与现有技术相比，本发明针对花生在储藏环节黄曲霉毒素污染控制困难、成本高、浪费严重等问题，利用分离、筛选的花生黄曲霉高效拮抗菌株Zn01及其有效拮抗物质抗菌脂肽，结合复合涂膜技术，通过在花生表面覆盖抗黄曲霉复合涂膜的方法抑制黄曲霉生长，进而减少黄曲霉毒素污染，是一种制备方便、方法简单、成本低廉、环境友好、易于推广的技术方法。能有效解决花生在储藏环节黄曲霉毒素污染控制困难、成本高、浪费严重等问题，能快速实现产业化。

附图说明

图1为未使用本发明情况下的黄曲霉生长状况示意图。

图2为使用本发明处理后黄曲霉生长状况的示意图。

图3为实施例1中接种高产毒黄曲霉进行对抗实验条件下施用和未施用抗菌复合涂膜效果对比图。

图4为实施例2中接种高产毒黄曲霉进行对抗实验条件下施用和未施用抗菌复合涂膜效果对比图。

图5为实施例3中以20μl/g施用抗菌复合涂膜的花生在接种高产毒黄曲霉进行对抗实验条件下施用效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

一种解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽、海藻酸钠复合涂膜抑制花生黄曲霉污染的方法，包括以下步骤：

第一步：以解淀粉芽孢杆菌Zn01为菌种，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液；种子培养的培养基为：胰蛋白胨10.0g/L,葡萄糖2.0g/L，牛心粉5.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸二氢钠2.5g/L，PH7.2；发酵获得发酵液的发酵培养基为：黄豆粉20g/L、玉米淀粉15g/L、葡萄糖3.0g/L、碳酸钙1.5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L、硫酸亚铁0.6g/L，初始PH7.2，在发酵生产中按体积比5％接种解淀粉芽孢杆菌Zn01，50L发酵罐液体深层发酵48h，发酵工艺参数为：初始PH7.2，温度37℃，转速180r/min,通气量50L/min，罐压0.1Mpa；

第二步：取第一步中获得的发酵液400ml，用6mol/L HCL调节至PH＝2.0，4℃静置过夜，利用10000r/min离心20min后沉淀用甲醇溶解、抽滤、滤液经旋转蒸发至干燥，用PBS缓冲液(0.02mol/L，PH7.2)定容至400ml,得抗菌脂肽粗提物，其抗菌效价约为5.0×10⁵IU/L；经发酵液拮抗物质活性分析，发酵液中主要活性物质是抗菌脂肽，其他如脂肪、蛋白、多糖等均无抑菌活性或抑菌活性非常弱，此抗菌脂肽粗提液不再分离、提纯只为实际生产应用时降低成本、简化操作考虑；

第三步：称取40g分析纯海藻酸钠于锥形瓶中，溶于1L去离子水中，加热至完全溶解，以总质量份数0.4％的添加量加入到第二步的抗菌脂肽粗提液中，制备出抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液；

第四步：在具有搅拌功能的密闭容器中，用喷雾装置将抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液均匀喷施于花生表面，复合涂膜液与花生最佳混合比例为20μl/g，在花生表面形成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜，50℃低温烘干或自然晾晒至花生水分10.0％以下，常温保存。

本发明从河南一地耕作良好花生种植田土壤中分离鉴定出一株对花生产毒黄曲霉具有优异拮抗性能的解淀粉芽孢杆菌，单位内部命名为Zn01。经实验证实，该菌对花生产毒黄曲霉的抑菌活性物质主要为抗菌脂肽，并且为胞外产物。发明人利用该菌株对花生产毒黄曲霉的高抗特性，利用复合涂膜技术，在花生储藏环节进行了实际应用效果实验。

实施例1

花生不同水分含量下抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜储藏应用：

将解淀粉芽孢杆菌Zn01菌株复苏活化，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液，发酵液分别经酸沉、离心、过滤、除菌、复溶等，制取解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽进一步粗提物。以0.4％的质量分数加入海藻酸钠，制成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液，以20μl/g的量喷施于花生表面覆盖成膜，分别于50℃低温烘干至不同水分含量，常温储藏，观察产毒黄曲霉在花生中的生长、产毒以及抗菌复合涂膜对其抑制情况。

结果:本发明抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜能显著抑制不同含水量的花生产毒黄曲霉生长及产毒，与未施用复合抗菌涂膜的花生相比，该复合抗菌涂膜对花生黄曲霉的产毒抑制差异显著。在接种高产毒黄曲霉进行对抗实验条件下施用和未施用抗菌复合涂膜效果见附图3。

实施例2

施用抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜花生在不同储藏温度下的应用：

将解淀粉芽孢杆菌Zn01菌株复苏活化，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液，发酵液分别经酸沉、离心、过滤、除菌、复溶等，制取解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽进一步粗提物。以0.4％的质量分数加入海藻酸钠，制成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液，以20μl/g的量喷施于花生表面覆盖成膜，分别于50℃低温烘干至15％水分含量，不同温度储藏，观察产毒黄曲霉在花生中的生长、产毒以及抗菌复合涂膜对其抑制情况。

结果:本发明抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜在不同温度下均能能显著抑制花生产毒黄曲霉生长及产毒，与未施用复合抗菌涂膜的花生相比，该复合抗菌涂膜对花生黄曲霉的产毒抑制差异显著，施用抗菌复合涂膜的花生可以在常温下储藏。在接种高产毒黄曲霉进行对抗实验条件下施用和未施用抗菌复合涂膜效果见附图4。

实施例3

喷洒不同量抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液成膜在花生常温储藏中的应用：

将解淀粉芽孢杆菌Zn01菌株复苏活化，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液，发酵液分别经酸沉、离心、过滤、除菌、复溶等，制取解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽进一步粗提物。以0.4％的质量分数加入海藻酸钠，制成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液，分别以1μl/g、5μl/g、10μl/gμl/g、20μl/g、50μl/g、100μl/g的量喷施于花生表面覆盖成膜，分别于50℃低温烘干至15％水分含量，常温储藏，观察产毒黄曲霉在花生中的生长、产毒以及抗菌复合涂膜对其抑制情况。

结果:本发明抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜在20μl/g喷洒量下能显著抑制花生产毒黄曲霉生长及产毒，随着喷施量的增加，该复合抗菌涂膜对花生黄曲霉的产毒抑制差异不再显著。以20μl/g施用抗菌复合涂膜的花生在接种高产毒黄曲霉进行对抗实验条件下施用效果见附图5。

实施例4

以解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽进一步粗提液-海藻酸钠复合抗菌涂膜在花生常温储藏中的应用：

将解淀粉芽孢杆菌Zn01菌株复苏活化，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液，取发酵液400ml,用6mol/L HCL调节至PH2.0，4℃静置过夜，10000r/min离心20min，沉淀用甲醇溶解，抽滤，滤液经旋转蒸发至干燥，用PBS缓冲液(0.02mol/L，PH7.2)定容至400ml,得抗菌脂肽进一步粗提物。以0.4％的质量分数加入海藻酸钠，制成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液，以20μl/g的量喷施于花生表面覆盖成膜，50℃低温烘干至水分含量10％以下，常温储藏3个月，用国标方法检测花生中黄曲霉毒素含量，观察产毒黄曲霉在花生中的生长、产毒以及抗菌复合涂膜对其抑制情况。

结果：此抗菌复合涂膜能显著抑制产毒黄曲霉生长及产毒，经检测储藏3个月后花生中黄曲霉毒素B₁含量小于5μg/kg，满足国家标准要求。

实施例5

以解淀粉芽孢杆菌抗菌脂肽粗提液-海藻酸钠复合抗菌涂膜在花生常温储藏中的应用：

将解淀粉芽孢杆菌Zn01菌株复苏活化，依次通过种子培养、扩大培养和发酵生产获得发酵液，发酵液经微滤去除菌体后得抗菌脂肽粗提液(经发酵液拮抗物质活性分析，发酵液中主要活性物质是抗菌脂肽，其他如脂肪、蛋白、多糖等均无抑菌活性或抑菌活性非常弱，此抗菌脂肽粗提液不再分离、提纯只为实际生产应用时降低成本、简化操作考虑)。以0.4％的质量分数加入海藻酸钠，制成抗菌脂肽-海藻酸钠复合涂膜液，以20μl/g的量喷施于花生表面覆盖成膜，50℃低温烘干至水分含量10％以下，常温储藏3个月，用国标方法检测花生中黄曲霉毒素含量，观察产毒黄曲霉在花生中的生长、产毒以及抗菌复合涂膜对其抑制情况。

结果：此抗菌复合涂膜能显著抑制产毒黄曲霉生长及产毒，经检测储藏3个月后花生中黄曲霉毒素B₁含量小于5μg/kg，满足国家标准要求。

基于花生黄曲霉污染的天然属性，以及防治一种污染又不带入新的污染的原则，生物防治的方法成为现在的研究热点。本发明所指抗菌脂肽是经微生物生长代谢产生的生物界中广泛存在的一类具有抗菌活性小肽，是两性分子，常带正电荷。在抗菌的同时对环境友好，并且抗逆性强，属生态友好型、环境友好型生态制剂。

本发明所指涂膜法是将环境友好型涂膜剂以喷雾的方法，在花生表面形成一层抗性涂膜，既能显著抑制黄曲霉生长和产毒，又能抑制花生呼吸作用，并且此复合抗菌涂膜对花生储藏温度和水分含量工作范围宽，能有效抑制黄曲霉生长和产毒，具有环保、高效、造价低、易于推广等优点。能有效解决花生在储藏环节黄曲霉毒素污染控制困难、成本高、浪费严重等问题，能快速实现产业化。

本发明针对花生在储藏环节黄曲霉毒素污染控制困难、成本高、浪费严重等问题，利用分离、筛选的花生黄曲霉高效拮抗菌株Zn01及其有效拮抗物质抗菌脂肽，结合复合涂膜技术，通过在花生表面覆盖抗黄曲霉复合涂膜的方法抑制黄曲霉生长，进而减少黄曲霉毒素污染，是一种制备方便、方法简单、成本低廉、环境友好、易于推广的技术方法。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。