专利名称：苯并吡喃酮类化合物与制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚酮类化合物，尤其是涉及一种源于红树林真菌(小穴壳菌素)的具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
红树林为分布于热带和亚热带海岸潮间带的木本植物群落，是海滩上特有的森林类型。生活在红树林区的红树林真菌(mangrove fungi)由于所处的生境特殊，其遗传及生理特性与其他生境中的微生物有所不同，具有产生新型活性物质的潜力，是开发新药的重要资源。近年来对红树林真菌活性物质的研究引起了国内外的关注，目前已从这类真菌中发现了一些具有药用价值的新化合物，如Isaka等(Isaka，M.，Chotika，S.，Morakot，T.AigialomycinsA-E，new resorcylic macrolides from the marine mangrove fungus Aigialus parvus.J.Org.Chem.2002，671561-1566.)从红树林真菌Aigialus parvus中分离到5种新的大环内酯类化合物(aigialomycins A～E)，其中aigialomycin D对KB细胞和Vero细胞的IC50分别为3.0μg/mL和1.8μg/mL。Lin等(Lin，Y.C.，Wu，X.Y.，Feng，S.，et al.FiveUnique CompoundsXyloketals from Mangrove Fungus Xylaria sp.from the South ChinaSea Coast.J.Org.Chem.2001，666252-6256.)从南海红树林真菌Xylaria sp.(no.2508)发酵液中分离到5种独特的化合物xyloketals A～E，当xyloketals A浓度为1.5×10-6mol/L时对乙酰胆碱酯酶有抑制活性。所以我们的研究具有较高的理论价值和实际应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新的来源于红树林真菌的具有潜在药用价值的苯并吡喃酮类化合物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明所述的小穴壳菌素化合物是从红树林真菌Dothiorella sp.HTF3(简称HTF3)的发酵培养物中提取分离到的新化合物，结构为6，8-Dihydroxy-1-(6-hydroxy-heptyl)-isochroman-3-one，称苯并吡喃酮类化合物，其结构式为 本发明所用的红树林真菌HTF3已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NOM203067，保藏日期为2003年8月29日。
本发明所述的苯并吡喃酮类化合物可从红树林真菌HTF3的发酵培养物中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的种子培养按质量比培养基为马铃薯去皮、切碎取20，加水煮沸后过滤，滤液中加葡萄糖1-3，琼脂1.5-2.0，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面培养；(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的发酵培养按质量比发酵培养基为马铃薯去皮、切碎取20，加水煮沸后过滤，滤液中加葡萄糖1-3，半海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基培养；(3)将上述培养好的发酵培养物过滤，分别得到发酵液上清和菌体；(4)菌体用甲醇充分浸提，合并提取液减压浓缩，得到石油醚相和水相，水相用乙酸乙酯萃取，有机相减压浓缩后用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，再用硅胶柱纯化得到苯并吡喃酮类化合物。
在步骤1中，挑取菌种接入斜面，28℃培养5-15天。在步骤2中，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，温度28℃、以100～160转/min震摇，培养5～10天。在步骤4中，水相用乙酸乙酯萃取2～5遍。
本发明所述的苯并吡喃酮类化合物具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。由此可见，本发明具有较高的理论价值和实际应用价值。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的种子培养
培养基以克为单位马铃薯去皮、切碎20，加水煮沸，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2，琼脂2.0，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃培养10天；(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的发酵培养发酵培养基以克为单位马铃薯去皮、切碎20，加水煮沸，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2，半海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，温度28℃、震摇(120转/min)培养7天；(3)将上述培养好的发酵培养液用4层纱布过滤，分别得到发酵液上清和菌体；(4)菌体在室温用甲醇充分浸提，合并提取液于50℃减压浓缩，得到石油醚相和水相，水相用乙酸乙酯萃取3遍，有机相减压浓缩后再用反相硅胶柱(45g RP-18)分离，收集甲醇∶水＝1∶1(V/V)的组分，浓缩后再用硅胶柱纯化，收集石油醚∶丙酮＝4∶1(V/V)的组分得到苯并吡喃酮类化合物(30mg)。
表1 苯并吡喃酮类化合物1H-NMR数据 表2 苯并吡喃酮类化合物13C-NMR数据
a)CD3OD b)CD3OD苯并吡喃酮类化合物的实验数据黄色油状物；ESIMS m/z 295.1[M+H]+(calcd forC16H22O5)；1H NMR and13C NMR(500MHz，CD3OD)见表1和表2。
实施例2采用体外测定细胞毒的MTT(Methyl Thiazolyltetrazolium)法检测苯并吡喃酮类化合物的抗肿瘤活性(1)肿瘤细胞株人B淋巴瘤Raji细胞、人口腔皮样癌KB细胞和人肝癌Hepg II细胞。
(2)材料a MTT(噻唑蓝)用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到终浓度5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃避光保存。
b SDS裂解液100g十二烷基磺酸钠(SDS)，1N HCl 10ml，加热溶解，蒸馏水定容至1000ml。
c细胞培养基(全培)一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)细胞培养基溶于1L双蒸水中；加入2g NaHCO3搅匀溶解后封口，置于4℃过夜，以自然沉淀除去杂质；次日加入10-15％已灭活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混匀后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。
(3)苯并吡喃酮类化合物的配置分别取一定量的苯并吡喃酮类化合物，用甲醇溶解并调整浓度为10mg/ml，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
(4)肿瘤细胞的培养a细胞活化取一干净烧杯，装入干净温水，水温调至37～40℃；将冻存管从液氮中取出迅速投入温水解冻，并将冻存细胞接入预装有细胞培养基的培养瓶内，在37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液、分瓶。
b细胞计数选对数生成期细胞，胰酶消化，移入离心管中，加全培至10ml，取一滴滴入计数板一侧凹槽中，倒置显微镜下计数。调整细胞数至1×105/ml。
c活性检测①96孔板在超净工作台内紫外光下照射1h；②在各孔中加入细胞悬液80μl，37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养24h；③加入20μl用全培梯度稀释成一系列浓度的苯并吡喃酮类化合物溶液，继续培养48h；④每孔加入MTT溶液10μl，轻轻震摇使颗粒溶解，37℃放置3h；
⑤取出培养板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解过夜；⑥用酶联反应仪590nm测定各孔吸光值，按下列公式计算抑制率抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％⑦以抑制率为纵坐标，受试样品浓度的对数为横坐标作图，求出抑制率为50％时的浓度即为IC50。
d实验结果苯并吡喃酮类化合物对三种肿瘤细胞均具有抗肿瘤活性，但其活性及抗瘤谱有些差异。苯并吡喃酮类化合物对人淋巴瘤Raji细胞的IC50均大于20μg/mL；苯并吡喃酮类化合物对人口腔上皮癌KB细胞和人肝癌HepgII细胞的IC50均大于10μg/mL。
实施例3与实施例1类似，其区别在于在红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的种子培养中，滤液中加葡萄糖1，琼脂1.8，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃培养10天；在红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的发酵培养中震摇160转/min培养5天；将上述培养好的发酵培养液用3层纱布过滤，分别得到发酵液上清和菌体；发酵液上清用等体积乙酸乙酯萃取3遍，水相用乙酸乙酯萃取5遍。
实施例4与实施例1类似，其区别在于在红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的种子培养中，滤液中加葡萄糖3，琼脂1.5，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃培养10天；在红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的发酵培养中震摇100转/分培养10天；将上述培养好的发酵培养液用5层纱布过滤，分别得到发酵液上清和菌体；水相用乙酸乙酯萃取2遍。
权利要求
1.苯并吡喃酮类化合物，其特征在于其结构为
2.如权利要求1所述的苯并吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于其步骤为1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的种子培养按质量比培养基为马铃薯去皮、切碎取20，加水煮沸后过滤，滤液中加葡萄糖1～3，琼脂1.5～2.0，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面培养；2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF3CCTCC NOM203067的发酵培养按质量比发酵培养基为马铃薯去皮、切碎取20，加水煮沸后过滤，滤液中加葡萄糖1～3，半海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基培养；3)将培养好的发酵培养物过滤，分别得到发酵液上清和菌体；4)菌体用甲醇充分浸提，合并提取液减压浓缩，得到石油醚相和水相，水相用乙酸乙酯萃取，有机相减压浓缩后用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，再用硅胶柱纯化得到苯并吡喃酮类化合物。
3.如权利要求1所述的苯并吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤1)中，挑取菌种接入斜面，28℃培养5～15天。
4.如权利要求1所述的苯并吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤2)中，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基的温度为28℃、以100～160转/min震摇，培养5～10天。
5.如权利要求1所述的苯并吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于在步骤4中，水相用乙酸乙酯萃取2～5遍。
6.如权利要求1所述的苯并吡喃酮类化合物用于制备抗肿瘤药物的应用。
全文摘要
苯并吡喃酮类化合物与制备方法及其应用，涉及一种聚酮类化合物。提供来源于红树林真菌的苯并吡喃酮类化合物及制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。该化合物是从红树林真菌Dothiorella sp.HTF
文档编号A61K31/366GK101029038SQ20071009129
公开日2007年9月5日 申请日期2005年8月15日 优先权日2005年8月15日
发明者沈月毛, 杜希萍, 郑忠辉, 黄耀坚, 宋思扬, 苏文金 申请人:厦门大学