专利名称：一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，涉及一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂及其制备方法。
背景技术：
鸭坦布苏病毒病又名“鸭黄病毒病”、“鸭出血性卵巢炎”、“蛋鸭黄病毒病”和“新型黄病毒BYD引起的产蛋下降综合征”，它是2010年在中国浙江、福建、山东、广东等地首次发现的一种新鸭病，主要发生于蛋鸭、也发生于种鹅、肉鸭。蛋鸭发生此病时，临床表现为肢体站立不稳，行走困难，采食量下降，产蛋量骤然减少，减蛋幅度很大，5天内减蛋超过90%或者绝产,部分病鸭在数日内死亡,死亡率为5% 10%。剖检病变为卵巢发生出血、萎缩、卵泡破裂或萎缩等。此前，国内外未见类似疾病。2010年藤泽泱、曹贞贞、万春和等、2011年苏敬良等证明该病病原属于黄病毒科黄病毒属坦布苏病毒(Flaviviridae, Flavivirus, Duck Tembusu virus, DTMUV)。2011年胡奇林等从广东省发生鸭坦布苏病毒病的蛋鸭中分离到I株鸭黄病毒JM株，对JM进行了鉴定，测定了 JM株部分理化和生物学特性，并进行了动物回归试验等。迄今为止，未见国内外有关鸭坦布苏病毒病免疫治疗方面的研究报道。因此，研制一种安全有效的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂及其制备方法对我国养禽业的发展具有重大意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂，该免疫治疗制剂安全性好，治疗鸭坦布苏病毒病效果显著，安全可靠。本发明的另一个目的在于提供上述鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法。为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法，包括如下步骤a.蛋鸭开产前高免对蛋鸭群开产前进行鸭坦布苏病毒病高强度免疫，当血清抗体琼扩效价达1:16为合格；b.采集高免鸭蛋采集经高免的蛋鸭群开产一个月内的初产蛋；c.清洁消毒将采集的高免鸭蛋清洁后，用质量百分比浓度为0. 5%的新洁尔灭溶液浸泡消毒20min,晾干；d.分离卵黄在无菌条件下，打破蛋壳倒净蛋清，把蛋黄倒入消毒好的大烧杯内；e.蛋黄匀浆在无菌条件下，将蛋黄置于消毒好的捣碎机内，加入一定比例的生理盐水进行匀浆；f.防腐抑菌在无菌条件下，匀浆后的卵黄加入质量百分比浓度为0. 01%的硫柳汞溶液或每毫升卵黄液加入青霉素、链霉素各一千单位进行防腐抑菌；g.封装保存在无菌条件下，将所述步骤e中经防腐抑菌的卵黄液摇匀后分装于消毒好的瓶中，冻结保存待用，保存温度为4-8°C或-20°C ；优选地，所述a步骤的具体操作为第一步将鸭黄病毒毒株的生产用种毒进行大规模培养，收获病毒液；第二步将收获的病毒液灭活；灭活病毒液I倍膜浓缩。第三步将灭活浓缩后的病毒液加入佐剂中，乳化后即得免疫用抗原；第四步取免疫用抗原免疫蛋鸭，末次免疫后15 20天，随机采血分离血清，用琼脂扩散试验(AGP)测定抗DTMUV抗体效价，直到抗体效价达1:16合格为止；进一步的，所述制得的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂所含的琼扩抗体效价达1:16以上；所述第三步的具体操作为将I体积份灭活后的病毒液加入2体积份的白油佐剂中， 在高速匀浆机中以8000 12000r/min乳化，即得免疫用抗原。优选地，所述生理盐水为与所述卵黄等体积质量浓度为0. 85%的氯化钠溶液。一种用所述制备方法制备得到的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂，含有抗鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果I、本发明的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂安全性好；2、治疗效果好。对发病后2天的产蛋鸭用本发明的免疫治疗制剂注射2ml/只后，第2天后精神转好、食欲增加、运动逐渐转为正常，产蛋率开始升高；对发病后第5天的产蛋鸭注射本发明之免疫治疗制剂2ml/只，第2天后发病鸭精神好转、食欲增加、运动逐渐转为正常，第5天后产蛋率开始升高。证明该免疫治疗制剂可以用于临床上治疗鸭坦布苏病毒病，具有重大的经济和社会效益。3、成本较低、适合工业化生产；本发明治愈每只产蛋鸭只需2ml免疫治疗制剂，成本约为0. 2元；需要的设备比较简单，适合大规模生产。
具体实施例方式本发明所述的实例是对本发明的说明而不能限制本发明，在与本发明相当的含义和范围内的任何改变和调整，都应认为是在本发明的范围内。下面结合实施例对本发明做进一步说明。具体实施例鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备步骤如下本发明抗原用种毒株是黄病毒科黄病毒属亚坦布苏病毒广东株(JM),于2011年10月14日送交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCV201131。I、毒种繁殖用JM株第7代尿囊液毒(代号JMDE7，ELD50为10-6. 0/ml)经尿囊接种11日龄麻鸭胚，0. 2ml/胚，37°C培养，每天照胚2次，弃去24h死亡胚胎，之后死亡鸭胚置4°C冰箱，于24h内无菌收获死胚尿囊液(以下称含毒尿囊液)，记号为JMDE8，放-80°C冰箱保存备用。取JMDE8尿囊液毒用麻鸭胚按殷震等[殷震，刘振华主编，动物病毒学，第二版，329-330，科学出版社，北京]的方法测定鸭胚半数致死量(ELD5tlX结果，JMDE8的ELD5tl为10_6 25/ml，作为基础种子和生产用毒种备用。2、病毒繁殖
按上述“毒种繁殖”的方法用生产用毒种接种11日龄麻鸭胚，收获尿囊液(代号为JMDE9)并测定毒价，毒价为106_ 5ELD5(l/ml，大于105 5ELD5(l/ml，判为合格，用于免疫用抗原。3、病毒灭活及检验将JMDE9尿囊液毒低速离心去沉淀后，加O. 3%甲醒，于37°C灭活24h，期间振摇数次。灭活完毕后置4°C冰箱保存备用。将灭活好的含毒尿囊液接种5枚11日龄麻鸭胚，O. 2ml/胚，37°C培养，每天照胚2次，观察7天，结果5枚胚全部成活，表明病毒灭活彻底。4、免疫用抗原制备将彻底灭活的尿囊液经用膜处理作I倍浓缩。将I体积份灭活浓缩后的病毒液加·入2体积份的白油佐剂中，在高速匀浆机中以8000 12000r/min乳化。
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5、免疫健康蛋鸭用上述免疫用抗原免疫健康蛋鸭，免疫方案如下在蛋鸭开产前60天用上述免疫用抗原经肌肉注射蛋鸭进行初次免疫，剂量为Iml/只；间隔14天，使用上述抗原经肌肉注射进行第二次免疫，剂量为I. 5ml/只；间隔28天，使用上述抗原经肌肉注射进行第三次免疫，剂量为2ml/只，第三次免疫后15 20天，随机采5只鸭血分离血清，用琼脂扩散试验(AGP)测定抗DTMUV抗体效价。所述琼脂扩散试验(AGP)具体操作步骤为I)、打孔在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔，(中间I孔，周围6孔)，孔径约5mm，孔距2mm-5mm，将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。2)、封底用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要融化为止，封闭孔的底部，以方侧漏。3)、加样用微量移液器或带有6-7号针头的O. 25ml注射器,吸取抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别加入外周的两孔中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔。每孔以加满不溢出为度，每加I个样品应换I个滴头。4)、作用加样完毕后，静止5min-10min，然后将平皿轻轻倒置放入湿盒内，37°C温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。AGP效价彡1:16为合格，当AGP效价彡1:16时，再加强免疫，剂量为2ml/只，直到抗体效价合格为止。6、收集免疫合格鸭群所产蛋，制备高免卵黄抗体。收集免疫合格鸭群所产蛋，按照下列步骤操作(I)高免蛋的消毒先用清洁水洗去蛋壳表面的粪污，再用O. 5%的新洁尔灭溶液浸泡消毒20min，然后晾干。无菌条件下打破蛋壳倒净蛋清，把蛋黄倒入消毒好的大烧杯内。(2)蛋黄匀浆将蛋黄置于消毒好的捣碎机内，加入等体积质量浓度为5%的氯化钠溶液生理盐水进行匀浆。(3)加防腐抑菌剂匀浆后的卵黄加入O. 01%硫柳汞或每毫升卵黄液加入青霉素、链霉素各一千单位进行防腐抑菌，摇匀后分装于消毒好的瓶中，冻结保存，保存温度为4-8。。或-20。。。(4)高免蛋黄液的检测
安全性检验健康雏鸡，每只皮下注射卵黄液1ml，观察一周应健康存活。无菌检验取高免卵黄液分别接种于分别接种于普通营养琼脂河厌氧肉汤培养基上于培养24小时,无细菌生长。7、鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的安全性试验共进行2次试验，第一次取11只127日龄健康蛋鸭随机分成2组，第I组5只，为空白对照组，经腿部内侧肌肉接种生理盐水，剂量为2. 5ml/只；第二组6只，为试验组，经腿部内侧肌肉接种实施例卵黄抗体，剂量为2. 5ml/只，隔离饲养，观察15天。结果，对照组和试验组鸭均未见不良反应，表明该卵黄抗体安全性好。具体结果见表1，表I为鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂安全性试验结果。
第二次试验取130日龄鸭15只，第I组7只，为空白对照组，经腿部内侧肌肉接种生理盐水，剂量为2. 5ml/只；第2组8只，为试验组，经腿部内侧肌肉接种生理盐水，剂量为
2.5ml/只，隔离饲养，观察15天。结果，对照组和试验组鸭均未见不良反应，表明该卵黄抗体安全性好。具体结果见表2，表2为鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂治疗试验结果。表I
权利要求
1.一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤 a.蛋鸭开产前高免对蛋鸭群开产前进行鸭坦布苏病毒病高强度免疫，当血清抗体琼扩效价达1:16为合格； b.采集高免鸭蛋采集经高免的蛋鸭群开产一个月内的初产蛋； c.清洁消毒将采集的高免鸭蛋清洁后，用质量百分比浓度为0.5%的新洁尔灭溶液浸泡消毒20min,晾干； d.分离卵黄在无菌条件下，打破蛋壳倒净蛋清，把蛋黄倒入消毒好的大烧杯内； e.蛋黄匀浆在无菌条件下，将蛋黄置于消毒好的捣碎机内，加入一定比例的生理盐水进行匀浆； f.防腐抑菌在无菌条件下，匀浆后的卵黄加入质量百分比浓度为0.01%的硫柳汞溶液或每毫升卵黄液加入青霉素、链霉素各一千单位进行防腐抑菌； g.封装保存在无菌条件下，将所述步骤e中经防腐抑菌的卵黄液摇匀后分装于消毒好的瓶中，冻结保存待用，保存温度为4-8°C或_20°C。
2.根据权利要求I所述的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法，其特征在于，所述a步骤的具体操作为 第一步将鸭坦布苏病毒毒株的生产用种毒进行大规模培养，收获病毒液； 第二步将收获的病毒液灭活；灭活病毒液I倍膜浓缩。
第三步将灭活浓缩后的病毒液加入佐剂中，乳化后即得免疫用抗原； 第四步取免疫用抗原免疫蛋鸭，末次免疫后15 20天，随机采血分离血清，用琼脂扩散试验(AGP)测定抗DTMUV抗体效价，直到抗体效价达1:16合格为止。
3.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法，其特征在于所述制得的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂所含的琼扩抗体效价达1:16以上。
4.根据权利要求2所述的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法，其特征在于所述第三步的具体操作为将I体积份灭活后的病毒液加入2体积份的白油佐剂中，在高速匀浆机中以8000 12000r/min乳化，即得免疫用抗原。
5.根据权利要求I所述的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂的制备方法，其特征在于所述生理盐水为与所述卵黄等体积质量浓度为0. 85%的氯化钠溶液。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述制备方法得到的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂，其特征在于含有抗鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体。
全文摘要
本发明涉及一种鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂及其制备方法，属于生物制药领域。本发明的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂，制备方法如下将鸭坦布苏病毒毒株的生产用种毒进行大规模培养，收获病毒液；随后将收获病毒液灭活并浓缩，将灭活并浓缩后的病毒液加入佐剂中，乳化后即得免疫用抗原；取免疫用抗原免疫蛋鸭，末次免疫后随机采血分离血清，用琼脂扩散试验(AGP)测定抗DTMUV抗体效价，直到抗体效价合格为止；收集免疫合格鸭群所产蛋，按常规方法制成高免卵黄抗体；本发明鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂含有抗鸭坦布苏病毒高免卵黄抗体。本发明制备的鸭坦布苏病毒病免疫治疗制剂有治疗效果好、安全可靠和成本低的优点，适合大规模工业化生产。
文档编号A61K39/42GK102793923SQ201210313900
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月29日 优先权日2012年8月29日
发明者魏平华, 胡奇林, 程怀灵, 孙敏华, 魏苏红, 董嘉文, 邱志欣, 李林林, 黄志松, 袁建丰 申请人:广州格雷特生物科技有限公司, 广东省农业科学院兽医研究所