肿瘤细胞膜/核膜双靶向肿瘤纳米药物缓释系统及其制备与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域中肿瘤细胞膜/核膜双靶向肿瘤纳米药物缓释系统及 其制备与应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是临床上最常见的肿瘤之一，其发病率逐年攀升，严重威胁着人类的身体健 康。广西壮族自治区是我国肝癌高发区，其死亡率是全国的两倍。肝癌往往恶性程度高，治 疗难度大，且转移时间早，发现时多已到中晚期，失去了手术治疗的机会。虽然新的治疗技 术不断更新，但是手术、化疗、放疗仍然是肿瘤治疗的中流砥柱。化疗药物能够直接杀死细 癌胞，是最理想且作用最明显的治疗手段之一。
[0003] 阿霉素（Doxorubicin, DOX)是临床上最常用的抗肝癌化疗药物之一，能有效地抑 制RNA和DNA的合成，从而达到抗肿瘤的作用。但是，因其严重的心脏毒性和抑制骨髓造血 功能，导致其长期处在临床二线用药的位置。脂质体阿霉素能够一定限度上减少药物副作 用，但是因为其不能够特异性地靶向肿瘤细胞，这导致其进入体循环后对人体的正常生理 机能造成严重冲击，大大降低了病人对药物剂量的承受能力和对疾病的抵抗能力。
[0004] 适配体（aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选得到的一类能够与特异性革El分子结 合的单链DNA、RNA。
[0005] 经聚乙二醇（PEG)修饰的IOOnm左右的脂质体纳米粒子（lipid bilayer, LB)是 如今研宄最热门的纳米药物载体之一。但是LB作用范围主要局限在肿瘤胞浆内，对于一些 作用在细胞核的药物，其能力有限，且其被内体吞噬后，稳定性大大降低，因而限制其作为 肿瘤多靶向治疗和药物释放的能力。
[0006] 介孔二氧化娃纳米粒子（Mesoporous Silica Nanoparticle，MSN)具有良好的生 物相容性、比表面积大、孔容孔径大、介孔孔径（2~50nm)可控以及结构稳定。
[0007] 核膜高穿透力肽 TATp (transactivator of transcription peptide，TATp)是 来源于HIV的TATp蛋白上一段小分子肽〇^1'-617-4找-1^8-1^8-4找-4找-61]1-Arg - Arg-Arg)〇
[0008] 虽然近年来肝癌的治疗取得了一定的进展，但是肝癌的治疗效果仍然不令人满 意。因此，迫切需要研宄开发新的治疗技术手段和策略来改善肝癌疗效。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是如何提高肿瘤药物对肿瘤的靶向性和杀伤力及如 何延长肿瘤药物在生物体内的循环时间。
[0010] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了纳米药物缓释系统。
[0011] 本发明所提供的纳米药物缓释系统是由核心和外壳组成的纳米粒子，所述外壳由 适配体、PEG和纳米脂质体组成，所述适配体通过所述PEG和所述纳米脂质体连接，所述适 配体能特异识别肿瘤细胞；所述核心由多肽修饰的纳米材料和负载于所述多肽修饰的纳米 材料中的抗肿瘤药物组成，所述多肽能穿透细胞核核膜。
[0012] 上述系统中，所述多肽的氨基酸序列可为序列表中SEQ ID No. 1，其名称为 transactivator of transcription peptide (TATp)〇
[0013] 上述系统中，所述纳米材料可为介孔二氧化硅纳米材料。所述介孔的孔径可为 2_10nm〇
[0014] 上述系统中，所述纳米材料可被氨基修饰。
[0015] 上述系统中，所述纳米材料的粒径可为30-70nm。所述纳米材料的粒径具体可为 50nm〇
[0016] 上述系统中，所述纳米脂质体的粒径可为60-200nm。所述纳米脂质体的粒径具体 可为80nm。
[0017] 上述系统中，所述肿瘤细胞可为实体肿瘤细胞。
[0018] 上述系统中，所述肿瘤细胞可为肝癌细胞。所述肝癌细胞具体可为H22肿瘤细胞。
[0019] 上述系统中，所述适配体的核苷酸序列可为序列表中SEQ ID No.2,其名称为 TLSlla0
[0020] 上述系统中，所述肿瘤药物可为阿霉素。所述阿霉素具体可为Sigma公司产品，货 号为D1515。
[0021] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述纳米药物缓释系统的制备方法。
[0022] 本发明所提供的所述纳米药物缓释系统的制备方法，包括用所述外壳包被所述核 心，得到所述系统。
[0023] 上述方法中，所述方法还可包括所述外壳的制备和/或所述核心的制备；
[0024] 所述外壳的制备可包括：制备PEG修饰的纳米脂质体；用所述适配体修饰所述PEG 修饰的纳米脂质体得到所述外壳；
[0025] 所述核心的制备可包括：用所述多肽修饰的纳米材料装载所述抗肿瘤药物得到所 述核心。
[0026] 上述方法中，所述PEG修饰的纳米脂质体的制备法可包括：用POPC(l-palmitoy l-2-〇leoyl-sn-glycero_3-phosphocholine)、cholesterol、PEG2000_DSPE(1，2-distear oyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000])、憐 脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺（MAL-PEG2000-DSPE)和a -tocopherol制备得 到所述PEG修饰的纳米脂质体。所述P0PC、所述cholesterol、所述PEG2000-DSPE、所述 MAL-PEG2000-DSPE 和所述 a -tocopherol 的摩尔比可为 52. 26 :41· 97 :5· 255 :0· 315 :0· 2。
[0027] 上述方法中，所述多肽修饰的纳米材料的制备可包括：用所述多肽修饰氨基化修 饰的纳米材料得到所述多肽修饰的纳米材料。
[0028] 上述方法中，所述用所述多肽修饰所述纳米材料可包括：氨基修饰所述纳米材料 得到氨基化修饰的纳米材料；用所述多肽修饰所述氨基化修饰的纳米材料得到所述多肽修 饰的纳米材料。
[0029] 上述方法中，所述纳米材料可为十六烷基三甲基氯化铵和三羟乙基胺反应得到物 质。所述反应温度可为95-100 °C，如98 °C。所述十六烷基三甲基氯化铵和所述三羟乙基胺 的质量比可为100 :4。
[0030] 上述方法中，所述多肽的氨基酸序列可为序列表中SEQ ID No. 1。
[0031] 上述方法中，所述纳米材料可为介孔二氧化硅纳米材料。所述介孔的孔径可为 2_10nm〇
[0032] 上述方法中，所述纳米材料的粒径可为30-70nm。所述纳米材料的粒径具体可为 50nm〇
[0033] 上述方法中，所述纳米脂质体的粒径可为60_200nm。所述纳米脂质体的粒径具体 可为80nm。
[0034] 上述方法中，所述肿瘤可为实体肿瘤。
[0035] 上述方法中，所述肿瘤可为肝癌。所述肿瘤具体可为H22肿瘤细胞引发的肿瘤。
[0036] 上述方法中，所述适配体的核苷酸序列可为序列表中SEQ ID No. 2。
[0037] 上述方法中，所述肿瘤药物可为阿霉素。所述阿霉素具体可为Sigma公司产品，货 号为D1515。
[0038] 为解决上述技术问题，本发明还提供了用于制备所述纳米药物缓释系统的成套试 剂。
[0039] 本发明所提供的用于制备所述纳米药物缓释系统的成套试剂，为所述适配体、所 述肿瘤药物、所述多肽和所述纳米材料这四种中的四种、任三种或任两种。
[0040] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述纳米药物缓释系统或所述成套试剂在 制备治疗和/或预防肿瘤药物中的应用；或所述成套试剂在制备脂质体中的应用。
[0041] 为解决上述技术问题，本发明还提供了治疗和/或预防肿瘤药物。
[0042] 本发明所提供的治疗和/或预防肿瘤药物的活性成分为所述纳米药物缓释系统。
[0043] 本发明中，所述纳米药物缓释系统按照所述纳米药物缓释系统的制备方法制备。
[0044] 本发明中，所述PEG可为PEG的二硬脂酸磷脂酰胺衍生物或其他PEG衍生物。所 述 PEG 具体可为所述 PEG2000-DSPE (1，2-distearoyl-sn-glycero_3-phosphoethanolamin e-N_[amino (polyethylene glycol) -2000])或所述磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰 亚胺（MAL-PEG2000-DSPE)。
[0045] 实验证明，本发明的纳米药物缓释系统（TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX)抑制肿瘤 的生长：TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX治疗后的肿瘤的体积分别为PBS、DOX、TATp-MSN/DOX、 TLSlla-LB-MSN/DOX、TLSlla-LB-TATp-MSN、LB-TATp-MSN/DOX 的 0.0615 倍、0.1507 倍、 0. 1034 倍、0. 4214 倍、0. 0791 倍、0. 2274 倍。
[0046] 实验证明，本发明的纳米药物缓释系统（TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX)能明显延 长荷瘤BalB/c裸鼠的生存时间：在TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX治疗的荷瘤BalB/c裸鼠 生存率为50 %时距第1次治疗的时间分别为PBS、DOX注射液、TATp-MSN/DOX注射液、 TLSl la-LB-MSN/DOX 注射液、TLSlla-LB-TATp-MSN 注射液和 LB-TATp-MSN/DOX 注射液治疗 的荷瘤BalB/c裸鼠生存率为50 %时距第1次治疗的时间的2. 47倍、1. 45倍、1. 91倍、I. 11 倍、2. 34 倍、1.42 倍。
[0047] 实验证明，本发明的TLSlla修饰的纳米药物缓释系统
[0048] (TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX)对肿瘤有靶向作用：荧光标记的 TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX处理的荷瘤BalB/c裸鼠在肿瘤处的荧光强度明显高于荧光标记 的LB-TATp-MSN/DOX处理的荷瘤BalB/c裸鼠在肿瘤处的荧光强度。
[0049] 实验证明，本发明的TATp修饰的纳米药物缓释系统（TLSlla-LB-TATp-MSN/DOX) 对细胞核有靶向作用，并