0. 8时，加入ImM左右的IPTG，在25°C培养3小时左右；
[0085] ③5000 - 6000rpm离心20-30min收集细胞，将离心收集的表达菌用含有约50mM 1^8-!1(：1(?!18.0)，2501111似(：110%甘油的缓冲液悬浮，然后11讯3000?1^3低温超高压细 胞破碎机（广州聚能生物科技有限公司）破菌3-5次，冰浴超声破菌20-30分钟；破菌液 13000rpm - 15000rpm 离心 25 - 40min 后收集上清液；
[0086] ④将上清液加入蛋白缓冲液预平衡的Ni2+亲和层析柱（GE公司）中，用20mM咪唑 梯度洗脱，收集l〇〇mM咪唑浓度下洗脱的目的蛋白，并浓缩；
[0087] ⑤将获得的蛋白再用Resource Q(GE公司）阴离子交换层析进行纯化。
[0088] (2)目的蛋白PPAR γ -LBD与阳性化合物相互作用鉴定
[0089] 将制备的纯度较高的目的蛋白质PPARy-LBD溶于pH = 7的醋酸铵缓冲液中， 然后与实施例1中的33种阳性化合物按照摩尔比1:3混合，孵育15分钟，离心后上样进 行质谱分析，利用Q-T0F质谱（美国waters公司），包括电喷源雾离子，分子量分析采用 MassLynxV4. 1 软件。
[0090] (3)实验结果
[0091] 利用质谱技术检测了实施例1中筛选出的部分PPAR γ激动剂1401、1402、1404、 1413、1609、1635、1636、1640、1701 等与 PPARy-LBD 蛋白的结合情况。
[0092] PPAR γ -LBD的质谱检测结果如附图7所示，PPAR γ -LBD与化合物分子结合后的质 谱检测结果如附图8Α-8Ι所示。
[0093] 如附图7所示，PPAR γ -LBD的分子量实测值为32911Da，与目的蛋白的理论分子量 一致。
[0094] 如附图8A所示，1401的分子量为251. l，PPARy -LBD与化合物1401孵育后，进行 质谱检测，在分子量为33161位置处可以检测到二者结合的峰。
[0095] 如附图8B所示，化合物1402的分子量为209. 09, PPAR γ -LBD与化合物1402孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33118位置处可以检测到二者结合的峰。
[0096] 如附图8C所示，化合物1404的分子量为209. 09, PPAR γ -LBD与化合物1404孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33117位置处可以检测到二者结合的峰。
[0097] 如附图8D所示，化合物1413的分子量为225. 08, PPAR γ-LBD与化合物1413孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33133位置处可以检测到二者结合的峰。
[0098] 如附图8E所示，化合物1609的分子量为175. 29, PPAR γ -LBD与化合物1609孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33081位置处可以检测到二者结合的峰。
[0099] 如附图8F所示，化合物1635的分子量为223. 1，PPAR γ -LBD与化合物1635孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33128位置处可以检测到二者结合的峰。
[0100] 如附图8G所示，化合物1636的分子量为224. 07, PPAR γ -LBD与化合物1636孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33144位置处可以检测到二者结合的峰。
[0101] 如附图8Η所示，化合物1640的分子量为199. 07, PPAR γ -LBD与化合物1640孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33105位置处可以检测到二者结合的峰。
[0102] 如附图81所示，化合物1701的分子量为229. 06, PPAR γ -LBD与化合物1701孵育 后，进行质谱检测，在分子量为33134位置处可以检测到二者结合的峰。
[0103] 综上所述，质谱结果显示化合物 1401、1402、1404、1413、1609、1635、1636、1640、 1701等与PPAR γ-LBD蛋白可以形成非共价复合物，进一步验证了上述几种化合物与 PPAR γ-LBD的结合活性。
[0104] 化合物 1401、1402、1404、1413、1609、1635、1636、1640、1701 等的结构式如下所 示：
[0105]
ο
[0107] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以 理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换 和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【主权项】
1. 具有结构通式（1)的丙酰胺类化合物作为PPARy蛋白的激动剂在制备治疗与 PPARy蛋白转录激活相关的疾病的药物中的应用，结构通式（1)如下所示：其中，R1选自氢、乙酰基、甲基、乙基、苯基、苄基、苯乙基、苯甲酰基；R2选自氢、CfC4 烷基、苄基、苯乙基、4-羟基苯乙基、4-甲氧基苯乙基、4-乙氧基苯乙基、3, 4-甲氧基苯乙 基、4-乙酯基苯乙基、呋喃-2-甲基、吡啶甲基、嘧啶甲基或2-(噻吩-2)-乙基；R3选自氢、 烷基、苄基、苯乙基、4-羟基苯乙基、4-甲氧基苯乙基、4-乙氧基苯乙基、3, 4-甲氧基 苯乙基、4-乙酯基苯乙基、呋喃-2-甲基、吡啶甲基、嘧啶甲基或2-(噻吩-2)-乙基。2. 根据权利要求1所述的应用，所述丙烯酰胺类化合物选自以下化合物：3. 根据权利要求1所述的应用，所述丙酰胺类化合物对PPARy蛋白有转录激活活性， 为PPARy蛋白的激动剂。4. 根据权利要求1所述的应用，所述治疗与PPARy蛋白转录激活相关的疾病的药物包 含具有结构通式（1)的丙酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或酯、水合物等，或具有结 构通式（1)的丙酰胺类化合物的组合。5. 根据权利要求4所述的应用，所述治疗与PPARγ蛋白转录激活相关的疾病的药物可 以制备成片剂、胶囊、乳液、注射液或其他药学上可接受的制剂。6. 根据权利要求1所述的应用，所述治疗与PPARy蛋白转录激活相关的疾病的药物包 含权利要求2所述的丙酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或酯，或权利要求2所述的丙 酰胺类化合物的组合。7. 根据权利要求6所述的应用，所述治疗与PPARγ蛋白转录激活相关的疾病的药物可 以制备成片剂、胶囊、乳液、注射液或其他药学上可接受的制剂。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的应用，其中，所述疾病为II型糖尿病、肥胖症、高 血脂症、炎症、血脂素乱、尚血压和癌症中的一种或多种。
【专利摘要】本发明涉及具有结构通式(1)的丙酰胺类化合物作为PPARγ蛋白的激动剂在制备治疗与PPARγ蛋白转录激活相关的疾病的药物中的应用，结构通式(1)如下所示：其中，R1选自氢、乙酰基、甲基、乙基、苯基、苄基、苯乙基、苯甲酰基；R2选自氢、C1-C4烷基、苄基、苯乙基、4-羟基苯乙基、4-甲氧基苯乙基、4-乙氧基苯乙基、3,4-甲氧基苯乙基、4-乙酯基苯乙基、呋喃-2-甲基、吡啶甲基、嘧啶甲基或2-(噻吩-2)-乙基；R3选自氢、C1-C4烷基、苄基、苯乙基、4-羟基苯乙基、4-甲氧基苯乙基、4-乙氧基苯乙基、3,4-甲氧基苯乙基、4-乙酯基苯乙基、呋喃-2-甲基、吡啶甲基、嘧啶甲基或2-(噻吩-2)-乙基。其中与PPARγ蛋白激活相关的疾病包括II型糖尿病、肥胖症、高血脂症、炎症、血脂紊乱、高血压和癌症中的一种或多种。
【IPC分类】A61K31/164, A61P9/12, A61K31/341, A61K31/4409, A61K31/265, A61P3/04, A61P35/00, A61K31/4402, A61K31/505, A61P3/06, A61K31/165, A61K31/381, A61P3/10, A61P29/00, A61K31/16
【公开号】CN105287483
【申请号】CN201510248903
【发明人】饶子和, 孙涛, 周红刚, 刘慧娟, 宋菲, 陈悦, 杨诚, 白翠改, 王振, 刘艳荣, 王静, 王波, 王权, 张成玉, 张强
【申请人】天津国际生物医药联合研究院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年5月15日