用水至 所需体积，无菌分装，即得。使用pH调节剂调节成品滴眼液的pH值为5. 5~7. 5。
[0029] 实施例7-9制备缓释型西罗莫司眼药膏原料组分和用量
[0030]
[0031] 制备方法：用丹参溶解西罗莫司全量，加入适量经灭菌、冷却的液状石蜡，研磨成 细糊状，过200目筛，再逐渐加入无菌、滤过的羊毛脂、黄凡士林混合物，混匀，即得。所用制 备器具及包装容器均须灭菌。
[0032] 实验例1缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的稳定性比较
[0033] 按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用 粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品，通过加速稳定性试验比 较缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的稳定性。
[0034] 因为本品对高温敏感，故确定本品的加速试验条件为温度25°C±2°C、相对湿 度20% ±5%。分别将三批缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂中试样品 (批号：20120701、20120702、201210703)，在市售包装条件下，放入恒温恒湿箱，在温度 25°C±2°C、相对湿度20% ±5%的条件下放置，分别于第1、2、3、6个月按时取样，按照实验 前拟定的质量标准草案进行测定。测定结果与〇月测定结果比较，结果见附表。
[0035] 缓释型西罗莫司滴眼剂在温度25°C ±2°C，相对湿度20% ±5%的条件下经6个 月考察，单个杂质及总杂质含量没有明显改变，前3个月西罗莫司含量没有明显变化，6个 月时有所降低；而普通型西罗莫司滴眼剂单个杂质及总杂质含量明显增加，西罗莫司含量 明显降低。以上试验结果均表明：缓释型西罗莫司滴眼剂稳定性较好。结果见下表。
[0036] 加速稳定性试验结果
[0037]
[0038] 实验例2缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的释放度比较
[0039] 按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用 粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品。采用丹参作为粘膜粘附 性聚合物释药系统可使治疗水平的活性药物（西罗莫司）在眼表滞留时间延长，显著减少 给药次数。通过测定滴眼液的释放度，从而可以预测缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗 莫司滴眼剂在眼表的滞留时间。
[0040] 照释放度测定法（《中国药典》2010年版二部附录XD)进行缓释型西罗莫司滴 眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的释放度检查。采用紫外可见分光光度法（UV法）进行释放 度测定。量取滴眼液l〇g，置烧杯底，小心加入l〇〇ml生理盐水，置37°C保温，作为释放度测 定溶液。分别于1、3、7、12小时取上清液5ml进行释放度测定，同时补充等量体积的生理盐 水。测定方法：取上清液5ml置于50ml容量瓶中，加0.lmol/L盐酸溶液摇匀并定容。再次 精密量取该溶液各5ml分别置于10ml容量瓶中，加硫酸溶液5ml摇匀，于室温静置30min。 取上述显色后的溶液，以0.lmol/L盐酸溶液为空白，照分光光度法，在482nm的波长处测定 吸收度，计算西罗莫司的含量和释放度。结果见下表。
[0041] 释放度测定结果（％)
[0042]
[0043] 结果表明，普通型西罗莫司滴眼剂释放较快，1小时就释放了约85%，而缓释型西 罗莫司滴眼剂释放比较缓慢，而且是逐渐释放，可以在眼表面长时间保持较高的药物浓度， 从而大大提高西罗莫司在眼部的生物利用度。
[0044] 实验例3缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂在眼部的药代动力学 比较
[0045] 按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用 粘膜粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品。
[0046] 给予受试药缓释型西罗莫司滴眼剂或普通型西罗莫司滴眼剂，兔左右眼同时给 药，给药剂量为50μL。分别于给药后的0. 0762、0. 5、2、6、12、24、48、72、96、120h各取1小 组（4只动物，雌雄各半）动物的泪液。泪液采集完后立即空气栓塞法处死兔子，按顺序取 房水、角膜、视网膜。测定眼组织中西罗莫司的药物浓度，计算药动学参数。结果见下表。 [0047] 新西兰兔单剂量给予缓释型西罗莫司滴眼剂后眼组织中西罗莫司的浓度
[0048]
[0050] 新西兰兔单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂后眼组织中西罗莫司的浓度
[0051]
[0052] 新西兰兔眼部单剂量给予缓释型西罗莫司滴眼剂后眼组织内的药动学参数
[0053]
[0055] 新西兰兔眼部单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂后眼组织内的药动学参数
[0056]
[0057] 结果表明：新西兰兔单剂量给予缓释型西罗莫司滴眼剂后，120h后眼组织中仍然 可以测到西罗莫司，在房水、角膜、视网膜中的半衰期均可达到30多个小时，故每天给药一 次即可在眼组织中达到有效的药物浓度。
[0058] 新西兰兔单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂48h后，眼组织中基本测不到西罗莫 司，在房水、角膜、视网膜中的半衰期约8个小时，单剂量给予普通型西罗莫司滴眼剂的达 峰浓度和曲线下面积均明显低于缓释型西罗莫司滴眼剂。为了维持有效的药物浓度，一天 需给药2-3次。
[0059] 实验例4缓释型西罗莫司滴眼剂与普通型西罗莫司滴眼剂的药效学比较
[0060] 我们研制的缓释型西罗莫司滴眼剂主要用于治疗葡萄膜炎，故观察其对实验性自 身免疫性葡萄膜视网膜炎（EAU)的治疗作用，并与普通型西罗莫司滴眼剂进行药效学比 较。按本发明实施例2记载的方法所制备的药剂作为试验品，采用普通方法（不选用粘膜 粘附性聚合物释药系统）制备的西罗莫司滴眼剂作为对照品，
[0061] 1牛视网膜可溶性抗原（soluble ant igen，S-Ag)的提取
[0062] 新鲜牛视网膜50只，匀浆、盐析、透析、离心，取上清液，使用二乙基胺乙基-琼脂 糖凝胶（DEAESepharoseFF，Pharmacia，Sweden)，C柱（2.6cmX10.0cm)，置 4°C低温层析 装置（LKB，瑞典）行离子交换层析分离纯化S-Ag。装柱（填充约85ml凝胶），用pH7. 5的 含三羟基氨基甲烷的盐酸层析缓冲液流洗平衡凝胶柱后，加入牛视网膜上清液样品。继续 层析缓冲液洗柱（流速50ml/h)至杂蛋白峰回落基线。0~0. 4mol/LNaCl线性洗脱，10 个柱体积（l〇〇ml/h)，每5ml收集一管（紫外线280nm监测）。S-Ag峰样品4°C双蒸水透析 24h，移入玻璃瓶中，置-30°C保存。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色显示S-Ag 为一主带，相对分子质量52X103。等电聚焦电泳S-Ag-条带，等电点6. 2。抗原分析结束 后冻干，-30°C保存。
[0063] 2EAU动物模型建立
[0064] 封闭群Wistar大鼠，雄性，体重150g左右，健康无眼病。随机数字表法随机分为 实验组和对照组。将福氏完全佐剂（completefreund'sadjuvant,CFA，Gibco)与等量 牛视网膜S-Ag混匀，制成乳剂，S-Ag终浓度1. 35mg/ml，大鼠双后足底部各注射0.lml，计 270μg/只。前期实验分别用100、200、300μgS-Ag免疫大鼠诱发EAU，经比较S-Ag200 ~ 300μg为最佳免疫剂量。
[0065] 同时，每只大鼠尾静脉注射10X109个菌体的灭活百日咳杆菌溶液；腹腔注射 0.lml大肠杆菌超声粉碎液离心后的上清液。
[0066] 3给药方案
[0067] 缓释型西罗莫司滴眼剂，每天给药1次，每次1-2滴。
[0068] 普通型西罗莫司滴眼剂，每天给药3次，每次1-2滴。
[0069] 4观察指标及组织学检查
[0070] 大鼠免疫后常规饲养，免疫后第2天起每日散瞳，用检眼镜、裂隙灯显微镜进行临 床检查，记录临床表现。大鼠免疫后第12天至第23天，可观察到炎症反应。可见晶状体前 囊散在炎性细胞沉着，晶状体中心区点状混浊，多在持续2~4d后消退；或瞳孔对散瞳药反 应差，晶状体前囊轻中度炎性细胞沉着，玻璃体内局灶性尘状混浊；或前房明显房水闪辉， 晶状体前囊大量炎性细胞沉着，晶状体中心区明显混浊，玻璃体明显混浊；或球结膜高度水 肿，睫状充血，虹膜血管扩张，虹膜后粘连甚至瞳孔闭锁，眼内无法窥入，有的大