一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株保藏号为CCTCC?NO：M2013626高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，是在保藏号为CCTCC?NO:M2012499的枯草芽孢杆菌AP1基础上，通过紫外诱变的方法筛选得到的突变株。所述突变株能显著提高碱性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达10132U/ml,较枯草芽孢杆菌AP1提高了12%，且突变株表达的碱性蛋白酶的酶学性质较枯草芽孢杆菌AP1没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域。在相同酶活添加量的情况下，本发明突变株产碱性蛋白酶对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果均显著优于竞争产品碱性蛋白酶，市场前景广阔。
【专利说明】一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程微生物构建筛选【技术领域】，具体涉及一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。
【背景技术】
[0002]碱性蛋白酶(alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27kDa。国内工业生产蛋白酶的菌株多是经枯草芽孢杆菌2709选育而来，是通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。碱性蛋白酶广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60%左右(Mala B.R.等，1998，Microbiology and Molecular Biology Reviews)。
[0003]碱性蛋白酶是目前市场上畅销的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤剂的去污效果，特别对血溃、汗溃、奶溃、油溃等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果。但目前碱性蛋白酶产品普遍被诺维信和杰能科两大酶制剂国际公司垄断，其具有酶活水平高、溶解速度快以及与洗涤剂配伍时耐受性强的优点。国内酶制剂企业要扩大在洗涤酶领域的市场份额，除了加速开发出发酵酶活高的新型碱性蛋白酶外，也需要提高碱性蛋白酶的产量，从而降低生产成本。
【发明内容】
·[0004]本发明的目的是提供一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。本发明在枯草芽孢杆菌API (Bacillus subtilis API)(保藏号为CCTCC N0:M2012499)的基础上，通过紫外诱变的方法筛选出一株碱性蛋白酶高产菌株，该高产菌株能高效分泌表达碱性蛋白酶，为低成本、规模化生产碱性蛋白酶奠定了基础。
[0005]本发明一方面涉及一种枯草芽孢杆菌突变株，为枯草芽孢杆菌AP2 (Bacillussubtilis AP2)，已于2013年12月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏号为CCTCC NO:M2013626o
[0006]本发明另一方面涉及上述枯草芽孢杆菌突变株的应用，是用于生产碱性蛋白酶。
[0007]上述枯草芽孢杆菌突变株生产的碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用。
[0008]本发明通过紫外诱变的方法获得了一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌突变株。所述突变株能显著提高碱性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达10132U/ml，较出发菌提高了 12%，且突变株表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域。在相同酶活添加量的情况下，本发明突变株产碱性蛋白酶对国际污布EMPAl 16及EMPA117上的去污效果均显著优于竞争产品碱性蛋白酶，市场前景广阔。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1:枯草芽孢杆菌4?1、4?1-56、4?1-63和么？1-69201^罐发酵酶活比较图。【具体实施方式】
[0010]下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。
[0011]对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下:
[0012]1、蛋白酶酶活测定方法:采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法(GB/T25327-2009)。
[0013]2、酶活单位的定义:Ig固体酶粉(或ImL液体酶),在一定温度和pH值条件下，Imin水解酪蛋白产生I μ g酪氨酸，即为I个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
[0014]3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括:福林使用溶液(一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀)，碳酸钠溶液(42.4g/L)，三氯乙酸(65.4g/L)，梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液(10.0g/L)。反应过程如下:试管中加入ImL酶液，40°C温浴2min,加入酪蛋白溶液ImL,摇匀后40 °C温浴IOmin,加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白对照先加入三氯乙酸,再加入酪蛋白溶液)。取出静止IOmin,慢速定性滤纸过滤。取ImL滤液，加碳酸钠溶液5mL,加福林试剂使用溶液ImL, 40°C显色20min,于680nm波长,用IOmm比色皿测定吸光度。
[0015]实施例1枯草芽孢杆菌APl的紫外诱变与筛选
[0016]1.1确定诱变筛选标记
[0017]将枯草芽孢杆菌APl (2012年12月5日保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC N0:M2012499)在含25μ g/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨平板(牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，琼脂1.5%，ρΗ7.2)上划线，37°C过夜培养。
[0018]挑取单菌落，接种至含有不同抗生素的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37 V、220rpm过夜振荡培养。枯草芽孢杆菌APl在不同抗生素中的生长情况如表1所示。
[0019]表1:枯草芽孢杆菌APl抗性验证
[0020]
【权利要求】
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2013626。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌，是由保藏号为CCTCCN0:M2012499的枯草芽孢杆菌APl菌株通过紫外诱变的方法筛选到的。
3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产碱性蛋白酶中的应用。
4.一种由权利要求1所述枯草芽孢杆菌生产的碱性蛋白酶。
5.权利要求4所述碱性蛋`白酶在洗涤剂中的应用。
【文档编号】C11D3/386GK103789227SQ201310648622
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2013年12月4日 优先权日:2013年12月4日
【发明者】齐建, 吴佳鹏, 纪海涛, 陈志兵, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司