专利名称：在植物中降低Bowman－Birk蛋白酶抑制剂的水平的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用共抑制或反义技术降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制剂水平的方法。
背景技术：
植物的种子含有贮存或称预留蛋白，这些蛋白在种子的发育过程中形成。在发芽及早期幼苗生长过程中，这些贮存物水解产生代谢中间体供生长的幼苗使用。在收获的种子中，贮存蛋白代表很重要的营养来源。通过改变贮存蛋白的组成以降低种子内不需要蛋白的量可以提高种子的营养价值。
在豆科植物种子中发现的一类主要的蛋白就是蛋白酶抑制剂，它们作为内源蛋白酶的调节因子并且保护植物免受昆虫及致病原的侵害。
植物蛋白酶抑制剂通常都是小分子量蛋白，其特点是具备和特定的动物蛋白酶偶尔也有植物蛋白酶结合的能力，因此使这些酶失去活力。研究表明有活性的蛋白酶抑制剂可能对人或其它动物有毒，给植物食品的营养价值带来负面影响，尽管在某些情况下它们是有益的。因此，有必要降低食物中的蛋白酶抑制剂的水平。
在豆科家族中蛋白酶抑制剂含量丰富，约占大豆蛋白的6％。当粗大豆饲料喂给单胃动物如鸡，大鼠和鹌鹑时，它们的抗营养本质导致脾增生，腺泡腺瘤及整体的生长减退。
大豆(Glycine max)种子蛋白是贮存蛋白的一个例子，它广泛应用于人类食物中。如婴儿食品豆腐，大豆蛋白分离物，大豆粉，纹理化的大豆纤维，以及酱油。大豆蛋白产物是人类需求中极好的价廉，高质量的蛋白来源。大豆也广泛应用于动物饲料成分。然而，这些必须进行适当加工，以去除或灭活蛋白酶抑制剂。
大豆蛋白酶抑制剂分为三类Kunitz胰酶抑制剂(KTi)，Bowman-Birk抑制剂(BBi)，及富含甘氨酸的胰酶抑制剂(GRSTi)。这些抑制剂的氨基酸序列中含大量的含硫氨基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)。
KTi的主要及大量表达形式是21.5 kDa的蛋白质，它对胰酶有特定的抑制活性。BBi是一种低分子量蛋白(8000kDa)，可以在不同的位点同时抑制胰酶及胰凝乳蛋白酶。至少有10种不同的同功型BBi已被报道。GRSTi是大豆种子中胰酶的次要抑制剂。
为了提高粮食的营养价值，采取了各种方法以降低大豆中蛋白酶抑制剂的含量及活性。这些包括物理的(热)和化学的方法对大豆产品进行处理，还包括通过常规育种技术对大豆进行遗传改造。
在任何热处理中必须小心，因为即使是需要热来破坏胰酶抑制剂，不适当的加热也会降低大豆蛋白本身的营养价值。进一步而言，尽管通过常规应用的热处理对大豆粉处理后可以通过变性使蛋白酶抑制剂大量失活，但仍有10-15％的残留活性。BBi的异常结构是导致残留活性的最可能的原因。BBi通过二硫键紧密交联在一起，使得单独的分子对热有很强的抗性。这样对种子或大豆制品进行热处理以降低抑制剂的表达是不完全成功的，而且从能量上讲是昂贵的，而且，大豆粗蛋白制品通常含有原大豆5％-20％的活性，(Rackis,J.J；Gumbmann,M.R.in Antinutrients and natrual toxicants in food；Ory,R.L；ED.；Food and Nutrition Press；Westport,CT,1981,P203)因此存在一点顾虑，由于这些未变性的BBi导致的残留活性可能是一种严重的健康问题(Liener,I.E.(1986)J.Nutr.166:920-923)。
另一种从原大豆中去除蛋白酶抑制剂的方法是溶剂抽提法。这种化学抽提方法在去掉各种各样抑制物质的同时也导致了种子中相当数量的油脂的丧失，这样，降低了它的食物价值。同时，还存在清除及处置溶剂的问题。
对大豆植株进行遗传改造以发展低抑制剂活性的品种这种思路也已被提出。然而这种思路有许多缺陷。在失去抑制剂的同时，相当数量的营养价时也丢失了。遗传变种与另一个品种之间的交叉授粉会导致蛋白酶抑制剂基因的重新表达。进一步而言，改变一个抑制剂的表达并不会影响另一个的表达。至今常规育种技术和组织培养技术不能产生一个低水平蛋白酶抑制剂的植株，尽管存在对这种植株的需要。
对降低蛋白酶抑制剂活性的需求以及热灭活的高昂费用导致了对大豆种质增加的研究以寻找缺乏蛋白酶抑制剂的种系。缺乏KTi的同等株系已经培育出来(Hymowitz,T.(1986),Nutritional andToxicological Significance of Enzyme lnhibitors in Foods,M.Friedman ed.Plenum Press,New Pork)。但是至今为止筛选的另外12,690个大豆品种中没有发现BBi的无效株。(Domagalski,J.M.etal(1992)Crop Sci 32:1502-1505)。BBi无效株曾经在野生多年生豆科植物中找到，但这些品种在常规大豆育种规程中并不常用，因为它们杂交有问题，同时存在早期荚果脱落现象。
采取的另一个措施以降低大豆中的蛋白酶抑制的水平就是有目的地表达Brazil Nut贮存蛋白。这个蛋白富含含硫氨基酸，这样，就抑制了同样富含含硫氨基酸的蛋白酶抑制剂的表达(WO95/27068)。这种方法被认为是有用的，因为两种蛋白共用的含硫氨基酸的贮备量在种子发育过程中是一定的。新蛋白的表达有效地竞争了这有限的含硫氨基酸的贮备，导致了蛋白酶抑制剂表达的减少。尽管有效，仍存在一些固有的限制。适于增加硫还原以及合成含硫氨基酸的环境条件含使抑制剂水平上升。因为生长条件不能预测，在商业上取得成功所必需的对抑制剂表达抑制的强有力控制并不能被保证。而且大豆培育者也努力提高种子中甲硫氨酸和半胱氨酸的含量以提高其营养价植。这样做他们就会选择那些可以提高合成甲硫氨酸和半胱氨酸能力的株系。这样会再次打破对蛋白酶抑制剂的抑制。而且，表达含硫新蛋白，其水平足以导致对蛋白酶抑制剂的抑制，这会导致大豆种子中引入一种新的可能的致敏蛋白，这需要在处理中有特别的考虑及在产品上的特别说明。
由于KTi无效株系的可用性，人们就希望获得对大豆植株进行遗传修饰以获得低水平表达BBi的植株。这不仅会降低热灭活蛋白酶抑制剂所需的热量，以及在产品中较低的残留活性，而且通过与已知的KTi无效株的杂交，可以产生整体蛋白酶活性都很低的株系。
BBi含有独立的胰酶和胰凝乳蛋白酶的结合位点(Liener,I.E.in R.J.Summerfield和A.H.Bunting(eds)Advances in LegumeScience,Royal Bot.Gardens,Kew England)。从大豆种子中至少纯化了10种BBi的同型物。然而，一些同型物都因蛋白裂解修饰而相互关联，据估计有三种由三个独立基因位点编码的抑制剂亚型。(Tan-Wilson et al.(1987)J.Agric.Food.Chem.35:974-981)。对GenBank进行大豆(Glycine.Max)BBi序列进行检索，结果显示了由Bowman确定的经典的BBi序列及两个同型物，命名为CⅡ和DⅡ。与Bowman同型物相比这些序列有73％和83％的同源性，蛋白序列有57％和75％的同源性。
这样就存在一种需要即通过共抑制或反义技术来提供一种消除大豆种子中BBi和其同型物的新方法。
发明概述本发明涉及一种降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的方法，它包括(a)用嵌合基团转染植物细胞，该基因包括编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的核酸中断，或者它的亚片段或者它的互补序列。它们都可操纵地和一个启动子相连。
(b)由从(a)获得的转染的植物细胞培育可育的成熟植株并获得种子。
(c)从由(b)获得的种子中进行筛选，选择那些与不含嵌合基因的植株相比Bowman-Birk蛋白酶抑制水平降低的种子。
另外对用此方法产生的植株和由此植株获得的种子也很感兴趣，这种植物Bowman-Birk蛋白酶抑制剂水平降低。
在另一方面，这个发明还涉及将用这种方法获得的植株与Kunitz胰酶抑制剂无效的植株进行杂交以及由此植株获得的种子。
在更进一步的方面，本发明还涉及杂种植株，该植株通过将用本(发明)方法制得的植株与任一亲本植株进行杂交获得，由此获得的后代在其基因组中包括一个嵌合基因，该基因包括编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的核酸片段或者一个亚片段或者其互补序列，它们都可操作地和一个启动子相连。
附图及序列的简要说明通过下面详细的描述及图表，序列说明本发明可以被更全面地理解，这些附图和序列说明构成本申请的一部分。
这个序列描述概要说明了下文附带的序列。这个序列表包含核苷酸的单字符和氨基酸的三字符，正如在Nueleic Acid Research13:3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-IUB标准所规定的，在所有核苷酸和氨基酸序列数据中所用的符号和格式均符合专利申请中核酸和/或氨基酸序列公开时的规则正如在37 C.F.R.§1.821-1.825和WIPO StandardSt.25所规定的。
图1为pDD1的质粒图，它包括BBi同型物CⅡ的有义(共抑制)构建物以便用于降低蛋白酶抑制剂水平。
图2显示了野生植株胚胎，载体对照转化植株组织以及pDD1转化胚胎体细胞的BBi表达的Western分析结果。
图3显示了野生植株及pDD1转化植株种子中BBi表达的Western分析结果。
SEQ ID NOS:1和2展示了用于从大豆mRNA中扩增BBi的同型物CⅡ正义和反义寡核苷酸引物序列。
SEQ ID NO:3示PCR产物的序列，该序列从大豆mRNA中获得，其中以SEQ ID NOS:1和2的寡核苷酸作为引物。
SEQ ID NO:4示由SEQ ID NO.3而来的BBi前体蛋白的氨基酸序列。
发明详述在本公开的上下文中，将用到了许多术语。
正如这里所用的，一个“分离的核酸片段”是指DNA或RNA的聚合物，它是单链的或双链的，视需要而定还可以包括合成的，非自然的或突变的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式存在的分离的核酸片段可由一个或几个DNA，基因组DNA或合成DNA的片段组成。
正如这里所用的，一个“分离的核酸片段”是指DNA或RNA的聚合物，它是单链的或双链的，选择地包括合成的，非自然的或改变了的核苷酸碱基。以DNA聚合物形式存在的分离的核酸片段可由一个或几个eDNA，基因组DNA或合成DNA片段组成。
术语“其功能等价的亚片段”是指分离核酸片段的一部分或亚序列，它不影响这段核酸片段编码的蛋白的功能属性或者不影响该核酸片段通过反义或共抑制技术介导的基因表达改变的能力。
术语“基本相似”在这里用来指核酸片段，其中一个或几个核苷酸碱基的变化导致一个或多个氨基酸的替换，但不影响DNA编码的蛋白质的功能属性。它们也指这样的核酸片段，一个或多个核苷酸碱基的改变并不影响核酸片段通过反义或共抑制技术介导的基因表达改变的能力。
“基本相关”(corresponding substantially)也指对本发明核酸片段进行修饰如缺失或插入一个或几个核苷酸，而就该转录产物通过反义或共抑制技术介导的基因表达的改变或最终蛋白分子功能属性的改变的能力而言，不会显著影响最终转录产物的功能属性。因此可以理解本领域的技术人员将会明白本发明所包括的不止那些具体的代表性序列。
例如，在本领域中已知的，基因表达的反义抑制和共抑制通过小于完整编码序列的核酸片段来实现，以及通过与被抑制的基因同源性不足100％的片段来实现。而且，改变一个基因从而导致在一个位点上产生化学上等同的氨基酸但并不影响编码蛋白的功能属性，这也是本领域中熟知的。例如，一个编码疏水氨基酸丙氨酸的密码子，可以替代为另一个编码疏水性稍弱的疏水残基，如甘氨酸或编码一个更疏水的残基如缬氨酸，亮氨酸或异亮氨酸的密码子。类似的，导致一个带负电的氨基酸替换成另一个带负电氨基酸的变化，例如天冬氨酸变成谷氨酸或者一个带正电的氨基酸替换成另一个带正电的氨基酸，如赖氨酸变成精氨酸，这些都可以期待产生一个功能上等价的产物。核苷酸的变化导致蛋白分子N-端或C-端部分的变化也期待着不改变蛋白的活力。每一项提出的修饰均是本领域的常规技术，正如确定编码产物生物活性保留程度一样。而且，本领域的技术人员认为在本发明中包括的基本相似的核酸序列也可以通过与这里的示范序列在中度严谨条件下(1×SSC,0.1％SDC,55℃)能够杂交的能力而确定。
一个氨基酸或核酸序列的“主要部分”(substantial portion)包括多肽链上足够的氨基酸序列或基因上的核苷酸序列以提供该多肽链或基因的有力的鉴定，可以通过本领域的技术人员进行的手工评价或借助算法如BLAST(Altschul S.F.et al(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)和Gapped Blast(Altschul S.F.etal.(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)进行计算机自动序列比较及鉴定。
“基因”是指一段可表达为一个特定蛋白核酸片段，该蛋白质包括位于编码序列之前(5’非编码序列)及之后(3’-非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指从天然分离出来的有其调控序列的基因，“嵌合基因”是指任何非天然基因，包括天然状态时不在一起的调控及编码序列。因此嵌合基因包括从不同来源所获得的调控和编码序列或同一来源来的调控及编码序列但与自然状态安排的状态不同。“内源性基因”是指在一个有机体的基因组中位于其天然位置的天然基因。一个“外源基因”是指在一个宿主有机体中通常找不到的基因，但通过基因转移导入宿主中的基因。外源基因包括插入非天然有机体的天然基因或嵌合基因。一个“转基因”是指通过转化程序转入基因组的基因。
“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列，“调控序列”是指位于编码序列上游(5’-非编码序列)，其中或下游(3’-非编码序列)的核苷酸序列，它可以影响转录，RNA加工或稳定性，或其所偶联的编码序列的翻译。调控序列包括，但并不限制于，启动子，翻译引导序列，内含子以及多聚腺苷酸识别序列。
“启动子”是指一段DNA序列，它可以控制编码序列及功能RNA的表达。启动子序列包括近端和许多远端上游序列，后者常指增强子。因此，启动子就是一段DNA序列，它可以激活启动子活性，它可以是启动子的内源性序列一个插入的异源成分，以提高启动子的水平或组织特异性。启动子可以整体从一个天然基因获得，或者由自然界存在的来源于不同启动子的不同因素组成，或者由合成DNA片段组成。本领域的技术人员都明白不同的启动子可以指导基因在不同组织或不同类型细胞中表达，或在不同发育阶段或对不同环境条件的反应条件下表达。可以使基因在大部分细胞类型大部分时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。在植物细胞中各种可以使用的新启动子常被发现，在OKamuro J.K和Goldberg R.B.(1989)编纂的Biochemistry of plants 15:1-82中可以找到许多的例子。而且更进一步认识到在大多数情况下调控序列的精确边界并未完全确定，有些差异的DNA片段也许可以有相同的启动子活性。
一个“内含子”是一个基因内部的插入序列，它并不编码蛋白序列的一部分。这样，这种序列转录成RNA但它们被切除并不翻译。这个术语也指切出的RNA序列。一个“外显子”是指基因序列的一部分，它转录出来并可在该基因来源成熟的信使RNA中找到，但它不必是编码最终产物的一部分序列。
“翻译引导序列”是指中启动子序列和编码序列之间的一段DNA序列。翻译引导序列在完全加工的mRNA中存在位于mRNA中翻译引导序列的上游。翻译引导序列可以影响mRNA初级转录本的加工，mRNA的稳定性或翻译效率。翻译引导序列已经被描述(Turner,R.和Foster,G.D.(1995)Molecular Biotechnology 3:225)。
“3’-非编码序列”是指一个编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸识别序列和其他可以编码影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列。聚腺苷酸信号通常通过影响向mRNA前体3’末端增加聚腺苷酸信号而被确定。应用不同的3’-非编码序列示例于Ingelbrecht I.L.等(1986)Plant cell 1:671-680。
“RNA转录本”是指RNA聚合酶催化的DNA序列的转录产物。当RNA转录本与DNA序列完全互补时它被称为初级转录本，或者它可以是初级转录本转录后加工而来的RNA序列，被称为成熟RNA。“信使RNA(mRNA)”是指无内含子的RNA，也可以在细胞内翻译成蛋白。“cDNA”是指双链DNA，它和mRNA互补并且来源于mRNA。“有义”RNA指RNA转录本，包括mRNA，因此可以在细胞内翻译成蛋白质。“反义RNA”是指RNA转录本，它可以和全部或部分靶初级转录本或mRNA互补，并阻碍靶基因的表达(U.S.Patent No.5,107,065)。反义RNA的互补性可以针对基因转录本的任一部分，即5’-非编码区，3’-非编码区内含子或编码序列。“功能RNA”是指反义RNA，核酶RNA或其他不被翻译的RNA但在细胞加工中有效应。
术语“操作相连”是指单核苷酸片段上的核酸序列的相连，因此一个的功能影响另一个。例如，当一个启动子能够影响编码序列的表达时它与编码序列操作相连(即编码序列在启动子的转录控制之下)。编码序列可以和调控序列正向或反向操作相连。
术语“表达”，正如此处所用，是指功能终产物的产生。基因的表达或过表达包括基因的转录和mRNA翻译成前体或成熟蛋白质。“反义抑制”是指产生可以抑制靶蛋白表达的反义RNA转录本。“过表达”是指在转基因有机体中基因产物的产量超过正常或非转化有机体的产量水平。“共抑制”是指可以抑制相同或基本相似的外源或内源基因的有义RNA转录本的产生。(U.S.Patent No.5,231,020)。
“改变的表达”是指在转基因有机体中基因产物的产生在数量或比例上与野生有机体中相关组织(器官和发育类型)的活性差异十分显著。
“成熟”蛋白是指翻译后修饰的蛋白；即初始翻译产物中的前导肽已经被去除的形式。“前体”蛋白是指mRNA的最初翻译产物，即前导肽仍然存在。前导肽可以但不必局限于细胞内定位信号。
“叶绿体转移肽”是一段氨基酸序列，它和一个蛋白质一起翻译并带领该蛋白进入叶绿体或其它细胞内可合成蛋白的质体。“叶绿体转移序列”是编码叶绿体转移肽的核酸序列。一个“信号肽”是一段氨基酸序列，它和一个蛋白质一起翻译并带领该蛋白进入分泌系统(Chrispeels M.J.(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42:21-53)。如果该蛋白定位于液泡，可以进一步加入一个液泡定向信号(上文)。如果该蛋白定位于核，现有的所有的信号肽都去掉取而代之的是一个核定位信号。(Raikhel N.V.(1992)Plant Phys.100:1627-1632)。
“转化”是指将核酸片段转入宿主基因组导致遗传上稳定的遗传。包含转化核酸的宿主有机体称为转基因有机体。谷类细胞优选的转化方法是粒子-加速或基因枪转化技术。(Klein et al(1987)Nature(London)327:70-73；U.S.Patent No.4,945,050)。
这里所用的标准重组DNA和分子克隆技术都是本领域中所熟知的并且在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆中有详细描述(Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Coldspring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(以下为Sambrook))。
“PCR”或“聚合酶链式反应”是一个合成大量特定DNA片段的技术，包括一系列重复的循环(Perkin Elmer.Cetus lnstruments,Norwalk,CT)。代表性地，双链DNA热变性，与靶序列3’端互补的两个引物在低温退火，然而在一个中等温度延伸。这样一套三个连续的步骤称为一个循环。
“表达构建物”是一个包含本发明的嵌合基因的质粒载体，可以被构建。质粒载体的选择依赖于转化植物宿主植株所用的方法。本领域的技术人员很清楚质粒载体上必须有那些元件以便成功转化，选择及扩增带嵌合基因的宿主细胞。熟练的技术人员也会认识到不同的独立地转化事件会导致不同水平和方式的表达(Jones.etal(1985)EMBOJ 4:2411-2418；De Almeida et al.(1989)Mol.Gen.Genetics 218:78-86)，这样，必须对多重事件进行筛选以获得预期表达水平和方式的株系。这样的筛选可通过DNA的Southern分析，mRNA表达的Northern分析，蛋白表达的Wertern分析及表型分析进行)。
如这里所用，“大豆”是指物种Glycine max,Glycine soja，或任何其它可与Glycine max生殖相容的物种。一个“株系”是指一群亲本相似的植株。在个体之间极少或基本没有遗传上的变异，即使在一个性状上也是如此。这样的株系通过一代或多代的自花授粉和选择获得，或者通过一个亲本进行营养繁殖包括组织或细胞培养的技术。“种质”是指任何植株，种系或植株群，它们具备在植物培育计划中作为亲本的潜能。术语“杂种”是指两个遗传上不同的两个个体杂交任何后代(见Rieger R.et al.(1968)A Glossary of Genetics andCytogenetics；Springer-Verlag:New York) 。
本发明涉及降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制剂水平的方法，它包括(a)用包含编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的核酸片段或它的亚片段或它的互补片段并与一个启动子相连的嵌合基因转化植物细胞；(b)从由步骤(a)获得的转化植物细胞培育可育的成熟植株并获得种子；(c)从由步骤(b)获得的种子进行筛选，筛选出的种子与不含嵌合基因的植物相比Bowman-Birk蛋白酶抑制剂水平降低。
本发明还涉及由本方法产生的转基因植株，这些植株包含降低水平的Bowman-Birk蛋白酶抑制剂以及由这些植株获得的种子。正如这里所用的，“植株”指的是一个完整植株，或植株的一部分或一个植物细胞或一群植物细胞。可用本发明方法的这类植株的范围通常和可转化的可产生种子的高等植物的范围一样大，包括含Bowman-Birk蛋白酶抑制剂或类Bowman-Birk蛋白酶抑制剂，即一种在功能上与Bowman-Birk蛋白酶抑制剂相当或相等的蛋白酶抑制剂的单子叶或双子叶植物。这类植物的例子包括但并不限制于大豆，小麦，玉米，蚕豆，苜蓿，豇豆，水稻，花生，大麦，和土豆。附加的信息可在下列参考文献中找到。普通豆类，Wilson,K.A.and Laskowski,M.Sr.((1975)J.Biol.Chem.250:4261-4267)；小麦，Odani,S.et.al.((1986)J.Biochem.100:975-983)；谷类Rohr meier,T.and Lehle,L.((1993)Plant Mol.Biol.22:783-792)；蚕豆，Asao.T.et al.((1991)J.Biochem.110:951-955)；苜蓿，Brown,W.E.etal((1985)Biochemistry 24:2105-2108)；豇豆，Morhy,L.andVentura,M.M.((1987)An.Acad.Bras.Cienc.59:71-81)，水稻Tashiro,M.et al.((1987)J.Biochem.102:297-306)花生Norioka,S.and Ikenaka,T.((1983)J.Biochem,94:589-599)；大麦Nagasue,A.et al.((1988)Agric.Biol.Chem.52:1505-1514)；土豆，Mitsumori,C.et al(1994)Plant Mol.Biol.26:961-969)。
转化技术对那些非常熟悉植物分子生物学的技术人员而言是很熟识的。植物细胞的转化方法包括但不止于颗粒轰击，微注时，电穿孔以及农杆菌-介导的DNA转移。
本发明的方法应用了嵌合基因，包括编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的核酸片段或其亚片段或其互补片段，它们与启动子操作相连，因此嵌合基因表达导致转化宿主细胞Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的抑制。
在嵌合基因构建中所用的核酸片段大部分与SEQ ID NO:3的序列相关，或与其亚片段或其互补片段或其亚片段相关。
在另一方面，本发明还涉及用本方法制得的植株与Kunitz胰酶抑制剂(KTi)缺陷植株杂交所获植株及由它所获的种子。
BBi水平下降的大豆植株的培育方便了去除大豆中所有的蛋白酶抑制剂，这可通过与现存的Kunitz胰酶缺陷种质系即Kunitztrypsin缺陷植株进行常规植物的杂交育种获得。这种双缺陷株的获得不仅节省了加工的花费，而且打开了新的种子市场，例如“全脂豆”用于饲养动物一样。全脂豆不用加工去除油料部分，因此饲料中含增加的热量价值。而且不经过热或化学变性BBi和KTi对蛋白产品进行变性，组成大豆分离物或浓缩物的贮存蛋白会保持天然构象，导致到现在为止的各种加工方法不可能保持的功能活性。
在另一方面，这个发明也关于杂种植株，该植株通过将用本发明方法获得的植株与任一亲本进行杂交获得，由此获得的后代在其基因组中包含含有与操纵子操作相连的编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂或其亚片段或其互补片段的核酸片段。由此植物获得的种子也令人感兴趣。
实施例本发明在下列实施例中进一步被说明，其中若非特别说明所有的部分及百分比均为重量，度数为摄氏度。应该理解这个实施例尽管显示了本发明的优选的实施方案，这个实施例仅仅是通过展示的方法给出的。通过上述讨论及这个实施例，一个本领域的技术人员可以确定本发明的核心特性，并且不会偏离其宗旨和范围，对本发明做出改变和修饰以适用不同的用途和条件。
实施例种子中Bowman-Bitk抑制剂水平下降的大豆植株根据从EMBL/GenBank/DDBJ database(登录号NO.KO1967)获得的Bowman-Birk蛋白酶抑制剂C-Ⅱ基因的cDNA序列，设计一对引物(SEQ ID NOS:2和3)用于RT-PCR(GeneampTMRNA PCR Kit；Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT)反应从由大豆子叶中获得的总RNA中得到C-ⅡcDNA的全基团。
5’-GCGGCCGCATGGTGGTGTTAAAGCTGTG-3’SEQ ID NO:15’-GCGGCCGCTAGTCATCATCTTCATC-3’ SEQ ID NO:2所获DNA片段用凝胶电泳进行分离，独立，克隆于pGem-T载体系统(Promega,Madison,WI)的pGem-T的EcoR V位点，产生pGem-T/BBi。在确定了方便下一步克隆的插入片段的正确方向后，BBicDNA用适用于二种DNA的SphⅠ和SacⅠ位点从pGem-T/BBi质粒切出，定向克隆入pZErO-1.1(Invitrogen,San Diego,CA)产生pZErO-1.1/BBi。为了产生活跃转录的基因。BBi cDNA利用限制位点XbaⅠ和kpnⅠ从pZErO-1.1/BBi质粒中切出，然后利用同样位点，定向克隆于质粒pML70(WO 94/11516和WO 97/47731)。这样产生了质粒pML70/BBi，它包括一个活跃的转录单位，包括(ⅰ)Kunitz胰酶抑制剂启动子(ⅱ)BBiC-Ⅱ cDNA处于有义方向(ⅲ)Kunitz胰酶抑制剂3’序列。这个转录单位通过用限制酶BamHⅠ消化从pML 70/BBi释放出来。该DNA片段用电泳分离，克隆入pKS18HH的BamHⅠ位点。产生pDD1。质粒pKS18HH包含下列遗传成分，(1)T7启动子/潮霉素B磷酸转移酶(HPT)/T7终止子序列(ⅰ)烟草花叶病毒的35S启动子(CaMV)/潮霉素B磷酸转移酶/胭酯碱合成酶(NOS)(ⅲ)去除了β-内酰胺酶编码基因的质粒载体pSP72(Promega)。这样，pKS 18HH质粒载体就可以使用潮霉素B作为大肠杆菌和我们的大豆转化及重生系统的选择剂。质粒pDD1(示于图1)用来轰击从大豆种子获得的体胚组织。
体胚培养的转化转化及繁殖大豆的体细胞胚的贮存液及培养基于WO 94/11516中描述。
大豆胚悬液培养在下述条件进行，35ml液体培养基(SB172)。旋转培养(150 rpm)28℃，光照为荧光混和物，16h白天8h黑夜。每两周进行一次亚培养，接种约35mg组织于35ml液体培养基中。
大豆胚悬液培养用pDD1通过颗粒枪轰击方法进行转化(见Kleinet al(1987)Nature 327:70)。转化使用Dupont BiolisticTMPDS1000/He装置。
5μl pDD1质粒DNA(1μg/μl),50μl CaCl2(2.5M)和20μl精胺(0.1 M)加入50μl 60mg/ml 1.0μm或0.6μm金颗粒悬液之中。该颗粒制备液搅动3分钟，在微量离心机中离心10秒钟去除上清。DNA包裹的颗粒用400μl 100％乙醇洗一次然后重悬于40μl无水醇中。DNA/颗粒悬液超声3次，每次1秒钟。然后在每个大载物盘上加入5μl DNA-包裹的全颗粒。
在一个空的60mm×15mm塑料盘中加入约200至600mg二周龄悬液培养物，用移液管吸去组织中的残留液体。这些组织离保留屏(retaining screen)3.5英寸远，轰击二次。膜爆发压力定于1100PSi。这个空腔抽至一28英寸汞柱的压力。每个实验中每个构建物轰击两个盘子。轰击之后，该组织分为两半、放回液体培养基中，按上述条件进行培养。
轰击四至六天后，液体培养基换为含50mg/ml Hygromycin的新鲜培养基。选择培养基每周都换新鲜的。轰击后六周，绿色的1转化的组织被分离出来，接种于三角瓶中，产生新的转化的胚悬液培养。
转化的胚块从液体培养培养液中取出，放在固体琼脂培养基上，SB 103，加入0.5％炭开始成熟。1周后，胚转入无炭的SB 103培养基，在SB 103培养基上3周后，正在成熟的胚分离出来，放在SB 148培养基上。胚成熟的条件是26℃，荧光和白炽光混合光照，168h白天8h黑夜轮流。SB 148培养基上6周后，胚用于分析β-conglycinin亚基蛋白的表达。每个胚块产生5至20个体胚。可育植株可从这些胚胎中产生，正如WO 94/11516所述。
BBi的检测BBi的检测通过常规的免疫印迹(Western)方法进行。对于体胚和种子的分析，8μl(2x)加样缓冲液加入8μl样品提取液。这种(2x)加样缓冲液包含100 mM Tris-HCl(pH7.5),4％SDS,0.2％溴酚兰，15％甘油和200 mMβ-巯基乙醇。该混合物95℃加热4分钟。然后将样品混合物进行微量离心(1200 rpm,20秒)然后上样于10％预制Ready GelTM(Bio-Rad,Richmond,CA)，该胶置于mini-Protein ⅡElectrophoresis Cell(Bio-Rad)。Bio-Rad Tris/甘氨酸/SDS缓冲液作为电泳缓冲液，电压为恒压125V。除了样品抽取液，每个胶都包含泳道分子量标准(Bio-Rad SDS-PAGE标准，低分子量范围)和一泳道从商用去脂大豆粉提取的大豆种子蛋白或从Sigma化学公司获得的BBi标准蛋白。电泳后，蛋白用Mini Trans-Blot ElectrophoreticTransfer Cell(Bio-Rad)从脉支持物(SPS-PAGE)上电转到硝酸纤维素膜上。转移在下述缓冲液中进行25 mM Tris,192 mM甘氨酸，20％v/v甲醇、pH8.3。转移25伏过夜。转移后硝酸纤维素印迹在TBS缓冲液(TBS:20 mM Tris,500 mM NaCl,pH 7.5)中漂洗10分钟。该膜然后在封闭液(5％脱脂奶粉溶于TBS缓冲液中)中浸泡，该溶液放于旋转摇床平台上轻微晃动，室温放置30分钟至1小时。然后倒掉封闭液，加入TTBS(0.05％Tween-20配于TBS中)，室温转摇，洗5分钟。这一步骤重复二次，漂洗之后，向膜中加入BBi抗体，室温轻摇孵育1至2小时。抗体按1∶5000稀释于抗体缓冲液中(1％牛奶溶于TTBS)。抗血清由Covance Research Products Inc.制备P.O.Bo×7200,Dewver,PA 17517，通过向Elite兔中注射BBi蛋白(1.0mg/ml)以产生Bowman Birk抑制剂蛋白特异的抗体。未结合的BBi抗体通过3次在TTBS室温5洗涤去除。该膜然后于室温孵育1-2小时于含有1∶2000稀释的辣根过氧化物酶连接的驴抗兔Ig的缓冲液中。(Amersham life Science)。为了去除多余的二抗，膜在TTBS中洗三次，每次5分钟。使用ECL Western blotting程度(AmorshamLife Science)使用检测试剂1,2进行检测。等体积的试剂1和试剂2混合，以便产生由以覆盖膜的溶液。该膜轻微振动使之在检测液中孵育1分钟。多余的液体吸干后，膜的蛋白侧向上放于胶片盒中进行胶中自显影1分钟。(Kodak Scientific Imaging Film X-OMAT AR)。
转化体胚的分析预实验已经做过以确定体胚发育中BBi可以被最初检测到的时间。未转化的胚的子叶(如上所示产生，只是未经轰击)被解剖，这些胚胎是启动成熟后5、7、9周胚胎，-80°冻存直至分析。子叶组织称重，抽提液按照10μl/mg组织加入，用Pellet PestleDisposable Mixer(Kimble/Kontes)进行组织研磨。抽提液由50 mMTris-HCl(pH7.5)。10 mM β-巯基乙醇(BME),0.1％SDS组成。这些样品在12000 rpm离心10分钟，上清用加样器转至一个新的微量离心管中。提取物-20℃保存至用。从这些预实验可知，BBi最早在启动成熟后5周表达。
从潮霉素选择获得了27个克隆。转化后的胚胎的分析在成熟启始后的5至7周用上述方法进行。5个克隆具有明显降低的或检测不到的BBi水平(表1)。这些胚胎特别标明。
表1转基因体胚的分析
图2显示了一个具代表性的转基因体胚的Western分析。从野生型对照和来源于事例2048-2-3胚胎中的组织中检测到一条对应于BBi很强的带，而样品2048-2-2所得胚胎中只检测到很少或几乎没有BBi。抑制了BBi表达的体胚克隆用于发芽产生植株。
转基因种子的分析种子切片，约重10mg，取材于RO:1种子，该种子来源于事例2048-5-4产生的转基因植株，该切片用上述方法分析BBi的存在。在分析的64个种子中，发现18个的BBi水平低于检测水平。另有12个种子发现有显示降低的水平。图3显示了具代表性的转基因种子的Western分析(按上述方法进行)，在泳道3和6的样品有明显降低的BBi水平，而其余泳道的样品均在检测限下。
这些数据清楚表明pDD1介导的由这种质粒转化的组织产生的胚胎和种子中BBi水平共抑制的有效性。
序列表<110>杜邦公司<120>在植物中降低BOW MAN-BIRK蛋白酶抑制剂的水平<130>BB-1143-A<140><141><150>60/097,450<151>1998年，8月21日<160>4<170>Microsoft Office 97<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>1gcggccgcat ggtggtgtta aagctgtg 28<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的寡核苷酸<400>2gcggccgcta gtcatcatct tcatc 25<210>3<211>350<212>DNA<213>大豆<220><221>CDS<222>(9)..(320)<220><221>成熟肽<222>(90)..(317)<400>3gcggccgc atg gtg gtg tta aag gtg gtt tct tgg ttc ttt tcc ttg tgg50Met Val Val Leu Lys Val Val Ser Trp Phe Phe Ser Leu Trp-25 -20 -15ggg tta cta atg cgc gca tgg gaa ctg aac ctc ttc aaa agt gat cac 98Gly Leu Leu Met Arg Ala Trp Glu Leu Asn Leu Phe Lys Ser Asp His-10 -5 -1 1tca tca agt gat gat gag tct rca aaa cca tgc tgt gat crc tgc atg146Ser Ser Ser Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Leu Cys Met5 10 15tgc aca gcc tca atg cca cct caa tgc cat tgt gca gat att agg ttg194Cys Thr Ala Ser Met Pro Pro Gln Cys His Cys Ala Asp Ile Arg Leu20 25 30 35aat tca tgt cac tca gct tgt gat cgc tgt gcg tgc aca cgc tcg atg242Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Asp Arg Cys Ala Cys Thr Arg Ser Met40 45 50cca ggc cag tgt cgt tgc ctt gac acc acc gac ttt tgc tac aaa cct290Pro Gly Gln Cys Arg Cys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Cys Tyr Lys Pro55 60 65tgc aag tcc agt gat gaa gat gat gac tag cggccgctgt tagtatatct 340Cys Lys Ser Ser Asp Glu Asp Asp Asp70 75taaattcttt 350<210>4<211>103<212>蛋白质<213>大豆<400>4Met Val Val Leu Lys Val Val Ser Trp Phe Phe Ser Leu Trp Gly Leu1 5 10 15Leu Met Arg Ala Trp Glu Leu Asn Leu Phe Lys Ser Asp His Ser Ser20 25 30Ser Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Leu Cys Met Cys Thr35 40 45Ala Ser Met Pro Pro Gln Cys His Cys Ala Asp Ile Arg Leu Asn Ser50 55 60Cys His Ser Ala Cys Asp Arg Cys Ala Cys Thr Arg Ser Met Pro Gly65 70 75 80Gln Cys Arg Cys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Cys Tyr Lys Pro Cys Lys85 90 95Ser Ser Asp Glu Asp Asp Asp100
权利要求
1．一种降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制剂水平的方法，包括(a)用包含与启动子可操作地相连的编码Dowman-Birk蛋白酶抑制剂的核酸片段或其亚片段或其互补片段的嵌合基因转化植物细胞；(b)由(a)步所获的转化植物细胞培育出可育成熟植株以获得种子；(c)从(b)步所获的种子中进行筛选，选择与不含嵌合基因植株相比，Bowman-Birk蛋白酶的水平降低的种子。
2．权利要求1的方法，其中所述核酸片段包括由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其功能上等价的亚片段。
3．权利要求1的方法，其中植物细胞选自大豆，小麦，玉米，蚕豆，苜蓿，豇豆，水稻、花生，大麦或土豆。
4．由权利要求1的方法所获植株，它含有降低水平的Bowman-Birk蛋白酶抑制剂。
5．由权利要求4的植株所获的种子。
6．通过将权利要求4的植株与缺陷Kunitz胰酶抑制剂的植株进行杂交所获植株。
7．由权利要求6植株所获种子。
8．将权利要求4的植株与任一亲本杂交所获的杂交植株，所获后代在其基因组中含与启动子操作相连的编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂的核酸片段或其亚片段或其互补片段的嵌合基因。
9．由权利要求8植株所获的种子。
全文摘要
本发明公开了用共抑制或反义技术降低植物中Bowman－Birk蛋白酶抑制剂水平的方法。
文档编号C07K14/81GK1313904SQ9980991
公开日2001年9月19日 申请日期1999年8月10日 优先权日1998年8月21日
发明者G·M·法德尔 申请人:纳幕尔杜邦公司