本发明属于天然药物制备领域，涉及一种来源于玫瑰树的具有新颖结构的生物碱类化合物，具体涉及一种单萜吲哚生物碱类化合物的制备方法及其在制备靶向抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
恶性肿瘤是一种多发病，死亡率较高，目前正严重威胁着人类的生命与健康，且正逐渐超过心血管疾病而成为威胁人类生命和健康的头号杀手。随着肿瘤发生机制的不断被阐明以及抗肿瘤作用靶点的不断被发现，多靶点抗肿瘤药物的发现成为新型抗肿瘤药物开发的重要方向。相对于单靶点药物和多种单靶点药物联合用药来说，多靶点药物可有效避免产生药物之间的相互作用，减少不良反应发生等优点。在各种分子靶点中，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase，PTK)是目前研究最多且效果最显著的抗肿瘤药物靶点之一，已成为靶向抗肿瘤药物的研究重点及热点，具有广阔的应用前景。PTK是一组催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化的酶系，其在细胞内的信号转导中起着十分重要的作用，它们在细胞生长、增殖、分化中发挥重要作用，不仅参与正常细胞的调节、信号传递和发育，也与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和凋亡密切相关。酪氨酸激酶功能的失调，会导致其下游信号途径激活，引起细胞增殖调节紊乱，最终导致恶性肿瘤的形成，通过阻断酪氨酸激酶可破坏肿瘤细胞的信号传递，从而达到抗肿瘤的目的。目前已有多种酪氨酸激酶抑制剂类抗肿瘤药物上市或进入临床研究，并取得了良好的临床疗效，如伊马替尼、舒尼替尼等靶向抗肿瘤药物。
玫瑰树属(Ochrosia Juss)植物隶属于夹竹桃科(Apocynaceae)，乔木，全世界共约39种，分布于马达加斯加到大洋洲的波利尼西亚，中国南部引入栽培的有玫瑰树(O.borbonica Gmel.)和古城玫瑰树(O.eliptica Labill.)2种[中国科学院中国植物志编委会.中国植物志.第63卷.科学出版社.北京:1977,pp38-39.]。玫瑰树属植物多数为民间药用植物，其枝叶提取液在抗肿瘤方面疗效显著，对于玫瑰树属植物的化学成分研究，以往主要集中在生物碱类成分的研究上，在临床上广泛使用并取得良好疗效的甲基羟基玫瑰树碱就是基于从玫瑰属植物中分离得到的玫瑰树碱设计合成出来的[Miller C.M,McCarthy F.O.Isolation,biological activity and synthesis of the natural product ellipticine and related pyridocarbazoles.RSC Adv.2012,2:8883-8918.]。正因为如此，多年来，该属植物备受植物化学界和药理学界的青睐，截至目前为止已从该属多种植物中分离鉴定了大量类型极其丰富并具有显著生物活性的化合物，如生物碱类[Carroll A.R,Addepalli R,Fechner G,et al.Alkaloids from the australian rainforest tree Ochrosia moorei.J.Nat.Prod.2008,71:1063-1065.；Salim A.A,Garson M.J,Craik,D.J.New indole alkaloids from the roots of Ochrosia acuminata.J.Nat.Prod.2004,67:1719-1721.；Fujii T,Ohba M,Tachinami T,et al.Structure and absolute configuration of the Ochrosia alkaloid ochromianine:syntheses of(±)-and(-)-ochromianine.Heterocycles 1989,29:1037-1040.；Lin Y.M,Juichi M,Wu R.Y,et al.Antitumor agents.LXIX.Alkaloids of Ochrosia acuminata.Planta Med.1985,6:545-546.；Akhter L,Brown R.T,Moorcroft D.10-hydroxy-and10-methoxyapparicine:two new alkaloids from Ochrosia oppositifolia.Tetrahedron Lett.1978,43:4137-4140.；Jorda W,Scheuer P.J.Hawaiian plant studies XIV.Alkaloids of Ochrosia sandwicensis.Tetrahedron 1965,21:3731-40.]、三萜类[Labib R.M,Ebada S.S,Youssef F.S,et al.Ursolic acid,a natural pentacylcic triterpene from Ochrosia elliptica and its role in the management of certain neglected tropical diseases.Pharmacogn.Mag.2016,12:319-325.；Liu Y.P,Huang L.G,Li K.K,et al.Studies on non-alkaloid constituents from Ochrosia borbonica.Zhongcaoyao 2015,46:798-802.]、甾体类[Liu Y.P,Huang L.G,Li K.K,et al.Studies on non-alkaloid constituents from Ochrosia borbonica.Zhongcaoyao 2015,46:798-802.]、木脂素类[Liu Y.P,Wang X.C,Li X.B,et al.Studies on non-alkaloid constituents from Ochrosia elliptica.Zhongguo Zhongyao Zazhi 2015,40:1508-1513.]、香豆素类[Liu Y.P,Wang X.C,Li X.B,et al.Studies on non-alkaloid constituents from Ochrosia elliptica.Zhongguo Zhongyao Zazhi2015,40:1508-1513.]、以及酚酸类[Liu Y.P,Wang X.C,Li X.B,et al.Studies on non-alkaloid constituents from Ochrosia elliptica.Zhongguo Zhongyao Zazhi 2015,40:1508-1513.]等多种结构类型化合物。
玫瑰树(O.borbonica)为夹竹桃科玫瑰树属植物，分布于马来西亚、新加坡、印度尼西亚、越南、斯里兰卡和马达加斯加等国家和地区，为我国引种栽培植物，主要栽培于广东省和海南省。截止目前为止关于玫瑰树的化学成分及其药理活性研究报道较少见，主要集中在从其中寻找具有抗肿瘤活性的生物碱类化合物[Zhang B.J,Yan J.M,Wu Z.K,et al.Alkaloids from Ochrosia borbonica.Helv.Chim.Acta 2013,96:2288-2298.；Svoboda G,Poore G,Montfrot M.L.Alkaloids of Ochrosia maculata Jacq.(Ochrosia borbonica Gmel.).Isolation of the alkaloids and study of the antitumor properties of 9-methoxyellipticine.J Pharm Sci-US 1968,57:1720-1725.；Poisson J,Miet C.9-methoxy ellipticine,an alkaloid from"yellow wood"Ochrosia borbonica,from Reunion Island.Ann.Pharm.Fr.1967,25:523-524.]。
技术实现要素：
本发明的目的是提供了一种从玫瑰树枝叶中分离得到的具有新颖结构的单萜吲哚生物碱类化合物ochroelline，该化合物具有显著地体外抗肿瘤活性，同时具有与与阳性对照药伊马替尼相当的蛋白酪氨酸激酶的抑制活性，可以进一步开发成以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物。
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种单萜吲哚生物碱类化合物ochroelline，其化学结构如下：
本发明的另一目的是提供一种从玫瑰树枝叶分离纯化化合物ochroelline的制备方法，包括以下步骤:
A.将阴干的玫瑰树枝叶粉碎后用甲醇或者90％乙醇冷浸提取或者加热回流提取2～4次，提取液经减压浓缩干燥，获得醇提取物；
B.将醇提取物加水制成混悬液，依次用等体积的石油醚和等体积的乙酸乙酯萃取，各萃取2～4次，获得石油醚萃取液；石油醚萃取液减压浓缩，得石油醚萃取物；
C.将石油醚萃取物进行柱色谱分离纯化，得到纯的化合物ochroelline。
进一步地，所述步骤C具体如下：①将石油醚萃取物用硅胶柱层析分离，石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比95:5，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50)，收集石油醚-丙酮(体积比80:20)洗脱物；②取石油醚-丙酮(体积比80:20)洗脱物经MCI树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比40:60，70:30，80:20)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物；③取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(体积比60:40，65:35，70:30)，收集甲醇-水(体积比65:35)洗脱物后进行浓缩；④取浓缩后的甲醇-水(体积比65:35)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比40:60)得到单体化合物ochroelline。
进一步地，所述步骤A具体如下：将阴干的玫瑰树枝叶粉碎后用2～4倍量的甲醇或者90％乙醇冷浸提取3次，提取液经减压浓缩干燥，获得醇提取物。
本发明的再一目的在于提供单萜吲哚生物碱类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是提供ochroelline在制备以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物方面的应用。
进一步地，肿瘤细胞株包括K562、SPCA-1、SGC-7901和BEL-7402四种肿瘤细胞株。
本发明首次从玫瑰树的乙醇提取物的石油醚萃取部位中分离鉴定了一个化学结构新颖的单萜吲哚生物碱类化合物。多种体外活性评价结果表明：该化合物具有显著地体外抗肿瘤活性，同时具有与与阳性对照药伊马替尼相当的蛋白酪氨酸激酶的抑制活性，可以进一步开发成以蛋白酪氨酸激酶为靶标的靶向抗肿瘤药物。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件。
实施例一：化合物ochroelline的制备方法(一)
1、阴干的玫瑰树枝叶粉碎后(28.2kg，广东)用3倍量的浓度90％乙醇溶液冷浸提取3次，每次提取一周，过滤，提取液减压浓缩得乙醇提取物1286.3g；
2、将该乙醇提取物加水制成混悬液，依次用等体积的石油醚和等体积的乙酸乙酯萃取，各萃取3次，获得石油醚萃取液；石油醚萃取液经减压浓缩，得石油醚萃取物280.8g；
3、将石油醚萃取物进行柱色谱分离纯化：将石油醚萃取物用硅胶柱层析分离，石油醚-丙酮梯度洗脱(95:5，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50)，收集石油醚-丙酮(体积比80:20)洗脱物，取石油醚-丙酮(体积比80:20)洗脱物MCI树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比40:60，70:30，80:20)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(体积比60:40，65:35，70:30)，收集甲醇-水(体积比65:35)洗脱物浓缩，取甲醇-水(体积比65:35)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比40:60)得到纯的化合物ochroelline(368.6mg)。
结构确证：通过旋光光谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱和质谱等多种现代波谱技术的综合解析，确定了化合物ochroelline的化学结构。白色无定形粉末,(c 0.12,CH3OH)；UV(CH3OH)λmax(logε)224(4.28),288(3.36)nm；IR(KBr)vmax:3422,2917,1628,1589,1446,1428,1242,1208,1168cm-1；1H NMR(400MHz,CDCl3)和13C NMR(100MHz,CDCl3)，数据见表1；HR-ESIMS m/z 307.1456(M+H；calcd for C19H19N2O2,307.1447)。
表1 ochroelline的NMR数据(CDCl3)
aMeasured at 400MHz.bMeasured at 100MHz.
实施例二：化合物ochroelline的制备方法(二)
1、阴干的玫瑰树枝叶粉碎后(9.8kg，海南)用4倍量的甲醇冷浸提取4次，每次3天，过滤，提取液经减压浓缩得甲醇提取物(528.2g)。
2、将甲醇提取物加水制成混悬液，依次用等体积的石油醚和等体积的乙酸乙酯萃取，各萃取4次，获得石油醚萃取液；石油醚萃取液减压浓缩，得石油醚萃取物(102.6g)；
3、将石油醚萃取物进行柱色谱分离纯化：将石油醚萃取物用硅胶柱层析分段，石油醚-丙酮梯度洗脱(95:5，90:10，80:20，70:30，60:40，50:50)，收集石油醚-丙酮(体积比80:20)洗脱物，取石油醚-丙酮(体积比80:20)洗脱物MCI树脂柱层析去除色素，用甲醇-水梯度洗脱(体积比50:50，70:30，80:20)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物进行反相硅胶柱层析，用甲醇-水梯度洗脱(体积比60:40，65:35，80:20)，收集甲醇-水(体积比70:30)洗脱物浓缩，取甲醇-水(体积比70:30)洗脱物用制备型高效液相色谱分离，流动相为乙腈-水(体积比40:60)得到单体化合物II(158.6mg)。
化合物II的结构确证：白色无定形粉末；HR-ESIMS显示化合物II的[M+H]+为m/z 307.1456；化合物II与实施例一中制备方法得到的化合物ochroelline共TLC，在三种展开体系下[石油醚-丙酮(8:2)、石油醚-乙酸乙酯(5:5)和氯仿-丙酮(9:1)]均为均一斑点，说明该化合物与化合物ochroelline为同一化合物。
实施例三：化合物ochroelline的抗肿瘤活性研究
1、实验方法：将四种常见肿瘤细胞株K562、SPCA-1、SGC-7901和BEL-7402分别用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基，在37℃、5％CO2培养箱中培养。采用MTT法进行细胞增殖抑制试验，主要操作为：取对数生长期的肿瘤细胞株，用0.25％的胰蛋白酶消化，10％新生小牛血清的RPMI-1640培养液调制成5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种180μL。在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养8-10h，待其贴壁，每个孔加入用PBS配制的样品液，使得样品终浓度分别为0.1、1、和10μg/mL。每个浓度平行3孔，继续培养44h后，每孔加入50μL MTT(1mg/mL-1，PBS配制)，在37℃，5％CO2条件下继续温育4h，吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，在酶联免疫检测仪上选择570nm，测定各孔的吸光值，同时设置空白组(仅加入含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物)，计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)＝(1-实验组3孔OD值平均值/对照组3孔OD值平均值)×100％。以抑制率作纵坐标，作回归曲线，计算出样品IC50值。采用SPSS13.0统计软件包进行数据处理及统计分析。
2、抗肿瘤活性实验结果(见表2)
由实施例一得到的化合物ochroelline对所选肿瘤细胞株K562、SPCA-1、SGC-7901和BEL-7402均显示不同程度的增殖抑制活性。
表2化合物ochroelline的抗肿瘤活性
实施例四：化合物ochroelline的抑制蛋白酪氨酸激酶活性
大鼠脑组织中PTKs的提取：将大鼠大脑取出，剔除脑膜，称重，加入4倍量的冷匀浆液。冰浴中用玻璃匀浆器高速匀浆，离心，收集上清液，再离心10min。收集上清液，上清液中含有胞浆型酪氨酸激酶，而沉淀可作为受体型酪氨酸激酶使用。留取少量上清液用于提取物中蛋白质的含量测定，其余分装，置于-70℃保存备用。
酶标板包被：将底物稀释液加入96孔酶标板中(每孔125μL)，37℃孵育过夜。移除板中过量底物液，加入磷酸盐缓冲液(PBS-Tween 20)洗涤，于37℃干燥2h。4℃保存备用。
PTK抑制剂筛选：先将样品加入酶标板中，37℃孵育，加入用激酶缓冲液稀释的ATP，37℃孵育，移除板中的反应液，洗涤；加入抗体复合物，37℃孵育；移除板中抗体复合物，洗涤，加入四甲基联苯胺(TMB)显色液，室温避光反应，加入终止液，于450nm波长处测定吸光度(A)值。阳性对照药为伊马替尼。按下述公式计算化合物ochroelline的抑制率：抑制率％＝(A正常-A样品)/(A正常-A空白)*100％
结果表明，化合物ochroelline对蛋白酪氨酸激酶具有显著的抑制作用(抑制率75.58％)，抑制活性和阳性对照药伊马替尼的抑制活性相当(抑制率68.29％)。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。