本发明属于植物保护和生物技术领域，尤其涉及一种检测稻瘟病菌与水稻互作时pwl2基因的上调表达的方法。
背景技术：
病原菌分泌的小分泌蛋白在半活体寄生菌从活体营养期向死体营养期的转变以及操控或改变寄主生理代谢途径中具有非常重要的作用。有研究表明，病原菌效应蛋白在植物中过表达后引起了病原菌侵染寄主过程中病害发生和寄主防御响应的改变。例如，病原细菌ⅲ型效应蛋白xopj在拟南芥中过表达后，使丁香假单胞杆菌番茄致病变种dc3000的hrcc非致病突变株侵染xopj过表达拟南芥转化株时胼胝质沉积明显减少。携带有dex诱导启动子的avrb拟南芥转化株则出现了叶片退绿黄化。丁香假单胞杆菌番茄致病变种dc3000的效应蛋白hopf2在拟南芥中过表达后使得avrrpt2介导的eti和hr反应无响应。油菜黄单胞杆菌叶斑病菌效应蛋白avrbst在拟南芥中过表达后引发植物细胞死亡、增强了拟南芥转基因植株对专性寄生菌(hyaloperonosporaarabidopsidis)侵染的抵御能力。
技术实现要素：
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种检测稻瘟病菌与水稻互作时pwl2基因的上调表达的方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明包括以下步骤：
(1)采用稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子喷雾接种到水稻叶片上；
(2)于0h,24h,48h,72h和96h的五个时间点取样；
(3)real-timert-pcr分析受侵染水稻不同时间点4个稻瘟菌效应蛋白基因的表达；
(4)采用用
具体地，所述步骤(3)中的4个稻瘟菌效应蛋白基因分别为avr-pita1,pwl2,bas107,slp1。
本发明的有益效果在于：
本发明是一种检测稻瘟病菌与水稻互作时pwl2基因的上调表达的方法，与现有技术相比，本发明克服了已有研究病原菌效应蛋白在病菌与寄主互作时功能研究的费时周期长等弊端，最终达到为今后研究病原菌效应蛋白在病菌与寄主互作时功能提供更为快速有效直接准确的目的。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明：
本发明包括以下步骤：
(1)采用稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子喷雾接种到水稻叶片上；
(2)于0h,24h,48h,72h和96h的五个时间点取样；
(3)real-timert-pcr分析受侵染水稻不同时间点4个稻瘟菌效应蛋白基因的表达；
(4)采用用
具体地，所述步骤(3)中的4个稻瘟菌效应蛋白基因分别为avr-pita1,pwl2,bas107,slp1。
本发明中稻瘟病菌孢子喷雾接种、水稻育苗、水稻总rna提取、real-timert-pcr及数据分析等方法均与常规相同。
本发明的有益效果是全面而准确的检测稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上，于不同时间点取样，提取水稻叶片总rna，real-timert-pcr分析受侵染水稻4个稻瘟菌效应蛋白基因(avr-pita1,pwl2,bas107,slp1)的表达。克服了已有研究病原菌效应蛋白在病菌与寄主互作时功能研究的费时周期长等弊端，最终达到为今后研究病原菌效应蛋白在病菌与寄主互作时功能提供更为快速有效直接准确的目的。具体方法是稻瘟菌效应蛋白基因过表达菌株孢子悬浮液喷雾接种于水稻叶片上，于不同时间点(0h,24h,48h,72h和96h)取样，提取样品总rna，real-timert-pcr分析4个稻瘟菌效应蛋白基因(avr-pita1,pwl2,bas107,slp1)。可快速、简便准确地了解病原菌效应蛋白基因在病原菌基因过表达菌株侵染水稻中表达量的影响，为直接进行病原菌基因功能研究及其在寄主与病原互作时的机制研究提供快速有效的方法，克服了已有研究病原菌效应蛋白在病菌与寄主互作时功能研究时需要进行大量的病原和寄主互作时的表型分析、进行水稻防御相关基因表达分析以及基因敲除等费时费力周期长的弊端。
实施例一：
采用稻瘟病菌孢子悬浮液，将孢子悬浮液接种于三叶一心期的水稻叶片上，28℃黑暗保湿24h后，置于温室中进行保温保湿。于接种0h、24h、48h和96h取样，trizolrna提取试剂盒提取样品总rna，利用实时荧光定量试剂盒进行4个稻瘟菌效应蛋白基因(avr-pita1,pwl2,bas107,slp1)的表达检测(表1)。
表14个稻瘟菌效应蛋白基因在受侵染水稻不同时间点的表达量
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。