本发明属于生物工程技术领域，具体涉及抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中稳定性中的应用。
背景技术：
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质粒广泛存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。质粒是分子操作的基础，经过改造质粒作为载体广泛的被应用在原核生物及真核生物的基因操作中。
目前用于生产各种抗生素，蛋白以及生活中常用的酶等的工程菌的构建主要有两种方法：第一种方法是将编码基因或基因簇整合到基因组上，这样外源基因编码的产物就可以在细胞内持续且稳定的表达。这种方法的缺点是表达量相对低，导致目的产物的获得量低；第二种方法是通过将表达目的产物的基因或者基因簇克隆到中高拷贝的表达质粒上，通过添加诱导剂或利用组成型启动子来大量表达目的产物。该种方法的缺点是质粒表达载体一般都不稳定，通常需要添加抗生素来维持。抗生素的添加不仅会增加生产成本，更重要的是会对环境造成污染，同时加重抗生素的扩散问题。不仅在生产中，在科学研究中，如何来维持质粒在不同宿主中的稳定性已成为限制质粒使用的重要因素。
为了能够克隆大片段DNA或增加质粒的转化效率，目前生产以及研究中常用的质粒通常较小，在胞内拷贝数较高。这些载体质粒不具有独立的复制，且在宿主细胞中的稳定性很差，克隆载体在细菌或者细胞中的维持主要通过添加抗生素来实现。目前质粒的拷贝数多少一般与质粒的稳定性呈反比，通过降低质粒的拷贝数来增加质粒的稳定性。对于如何增加中高拷贝质粒的稳定性目前还很少有研究报道，而通过在质粒上引入单独的抗毒素来增加质粒的稳定性方面的研究还没有报道。
技术实现要素：
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本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用。
本发明的第一个目的是提供抗毒素SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用，所述的抗毒素SO_1445的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述的抗毒素SO_1445的抗毒素基因SO_1445在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用。
优选，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第三个目的是提供一种含有抗毒素基因SO_1445或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的重组质粒，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的质粒优选为pCA24N、pUC19或pACYC184。
本发明的第四个目的是提供一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有上述的重组质粒。
所述的宿主细胞优选为大肠杆菌BW25113。
本发明的第五个目的是提供一种提高质粒在宿主细胞中的稳定性的方法，其特征在于，将抗毒素基因SO_1445或如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接到质粒上构建成重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主细胞中，所述的抗毒素基因SO_1445的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的质粒优选为pCA24N、pUC19或pACYC184。
本发明从希瓦氏菌MR-1中克隆得到抗毒素基因SO_1445，将抗毒素基因SO_1445连接到质粒上，在不添加抗生素的条件下，在不同天数时检测引入抗毒素基因SO_1445的重组质粒与空质粒在宿主中的稳定性，发现引入抗毒素基因SO_1445的重组质粒的稳定性相较空质粒显著增加。本发明不仅有望减少抗生素在生产以及科学研究中的使用，同时为稳定质粒在细菌宿主中的存在提供了新的方法与策略。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，仅用于例证，而不是对本发明保护范围的限制。
实施例1：在常用质粒pCA24N，pUC19，pACYC184上克隆抗毒素基因SO_1445
(1)在常用质粒pCA24N上克隆抗毒素基因SO_1445
pCA24N质粒为模式菌大肠杆菌中的中等拷贝数表达载体，常用于特定蛋白在胞内的表达纯化等。利用Tiangen试剂盒提取野生型希瓦氏菌MR-1基因组DNA作为后续PCR克隆的模板；设计PCR扩增抗毒素基因SO_1445(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pCA24N)：5’-GCCAGCACAATCAAACCCGTGTC-3’；下游引物SO_1445-R(pCA24N)：5’-CCTTTGTGGCATGTAGGGGCTGCC-3’。以SO_1445-F(pCA24N)和SO_1445-R(pCA24N)为引物，野生型希瓦氏菌MR-1基因组DNA为模板，PCR扩增抗毒素基因SO_1445的编码区，PCR扩增条件为：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约300bp的目的基因片段。
再将其与经sacI单酶切，去磷酸化处理的载体pCA24N用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)进行连接，将连接产物转入大肠杆菌BW25113感受态细胞，筛选阳性转化子，PCR验证并送测序公司测序获得重组质粒pCA24N-SO_1445以及含有该重组质粒的目的菌株。
(2)在常用质粒pUC19上克隆抗毒素基因SO_1445
pUC19质粒为常用的高拷贝质粒，不含有可供目的基因使用的诱导型启动子，在进行克隆时将抗毒素基因SO_1445以及SO_1445上游的启动子区域(上游290bp，如SEQ ID NO.1的第1～第290位碱基所示)一同克隆到pUC19中(即将SEQ ID NO.1所示的序列克隆到载体pUC19中)，pUC19采用商业化的pMD19-T(TaKaRa公司)替代。设计PCR扩增抗毒素基因SO_1445以及上游启动子区域的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pUC19)：5’-AAGGTCATAATGCTTCTGCGACG-3’与下游引物SO_1445-R(pUC19)：5’-CTATTTGTGGCATGTAGGGGCT-3’。以野生型希瓦氏MR-1基因组DNA为模板，以SO_1445-F(pUC19)和SO_1445-R(pUC19)为引物，PCR扩增抗毒素基因SO_1445以及上游启动子区，PCR扩增条件为：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约600bp的目的基因片段，将其克隆入载体pMD19-T(TaKaRa公司)中，将重组质粒转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，筛选阳性转化子，PCR验证并送测序公司测序获得重组质粒pUC19-PSO_1445-SO_1445以及含有该重组质粒的目的菌株。
(3)在常用质粒pACYC184上克隆抗毒素基因SO_1445
pACYC184质粒的复制起始区来源于p15A质粒，它的特点是可以与ColE1类型的质粒(pUC19，pBR322等)在细胞内兼容。pACYC184质粒不含有可供目的基因使用的诱导型启动子，因此在进行克隆时将抗毒素基因SO_1445以及SO_1445上游的启动子区域(上游290bp，如SEQ ID NO.1的第1～第290位碱基所示)一同克隆到pACYC184中(即将如SEQ ID NO.1所示的序列克隆到载体pACYC184中)。与前述构建方法相同，设计PCR扩增抗毒素基因SO_1445的引物，引物序列如下：上游引物SO_1445-F(pACYC184)：5’-CTAGTCTAGAAAGGTCATAATGCTTCTGCGACG-3’(下划线部分为XbaI酶切位点)；下游引物SO_1445-R(pACYC184)：5’-CTAGTCTAGACTATTTGTGGCATGTAGGGGCT-3’(下划线部分为X baI酶切位点)。以野生型希瓦氏MR-1基因组DNA为模板，以SO_1445-F(pACYC184)和SO_1445-R(pACYC184)为引物，PCR扩增抗毒素基因SO_1445以及上游启动子区域，PCR扩增条件为：先95℃5min；然后95℃30s，56℃30s，72℃1min，共30个循环；最后72℃10min。反应结束后，将PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化约600bp的目的基因片段，将纯化后的目的基因片段与提纯的pACYC184利用相同的限制性内切酶XbaI进行酶切，酶切后的pACYC184进行去磷酸化处理，然后将具有相同粘性末端的目的片段与pACYC184用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)进行连接，将连接产物转入大肠杆菌BW25113感受态细胞，筛选阳性转化子，PCR验证并送测序公司测序获得重组质粒pACYC184-PSO_1445-SO_1445以及含有该重组质粒的目的菌株。
实施例2：检测克隆有抗毒素基因SO_1445的重组质粒与空白质粒在大肠杆菌中的稳定性
对实施例1中构建的含有重组质粒的目的菌株进行质粒稳定性测试，具体方法如下：
(l)将含有空载体pCA24N的大肠杆菌BW25113以及含有重组载体pCA24N-SO_1445的大肠杆菌BW25113目的菌株单克隆分别接种于25mL培养基(每升培养基中含有胰蛋白胨10g，酵母粉5g和NaCl 10g，120℃灭菌20min)中，在37℃，180rpm条件下振荡培养12小时。
(2)每12h转接一次，每次按照1％的接种量进行转接。
(3)每传代两次(24h)，对质粒的丢失情况进行检测。检测方法为：将对应时间点的菌液进行梯度稀释，梯度稀释后涂布到无抗生素的LB平板(总的菌数)，挑取单菌落对应点在氯霉素(30μg/mL)的LB抗性平板(含有质粒的菌数)。本发明中用(含有质粒的细菌数/总的菌数×100％)代表质粒的维持率。
(4)统计不同培养天数下，空质粒pCA24N与携带了抗毒素基因SO_1445的重组质粒pCA24N-SO_1445在大肠杆菌中的稳定情况(见表1)。
(5)利用相同的检测方法，在大肠杆菌中检测重组质粒pUC19-PSO_1445-SO_1445与空质粒pUC19在对应LB平板(总的菌数)与氨苄青霉素(100μg/mL)LB抗性平板(含有质粒的菌数)的生长情况，统计两者在不同天数的稳定情况(见表2)；在大肠杆菌中检测重组质粒pACYC184-PSO_1445-SO_1445与空质粒pACYC184在对应LB平板(总的菌数)与氯霉素(30μg/mL)LB抗性平板(含有质粒的菌数)的生长情况，统计两者在不同天数的稳定情况(见表3)。以上质粒稳定性检测均重复至少2次。
表1 大肠杆菌在不添加抗生素进行传代培养时胞内的质粒稳定性情况
表2 大肠杆菌在不添加抗生素进行传代培养时胞内的质粒稳定性情况
表3 大肠杆菌在不添加抗生素进行传代培养时胞内的质粒稳定性情况
质粒的稳定情况统计结果如表1，2，3所示。结果显示，实施例l中构建的重组质粒pCA24N-SO_1445，pUC19-PSO_1445-SO_1445和pACYC184-PSO_1445-SO_1445与相应的空质粒相比稳定性显著提高。与pCA24N相比，pCA24N-SO_1445在五天之后的稳定性高于前者500倍左右；与pUC19相比，pUC19-PSO_1445-SO_1445在五天之后的稳定性高于前者3000倍左右；与pACYC184相比，pACYC184-PSO_1445-SO_1445在六天之后的稳定性高于前者60倍左右。
实施例3：克隆其它基因到质粒pCA24N上，并不能够增加质粒在大肠杆菌中的稳定性为了排除基因SO_1445增加质粒稳定性只是因为改变了质粒的结构这种可能性，我们分别对选取的阴性对照基因在相同的宿主中检测了它们稳定质粒pCA24N的能力。
(1)根据实施例1步骤(1)中pCA24N重组质粒的构建方法，将基因mqsA，mazE以及melA(AT00_02290)分别克隆到质粒pCA24N中。基因mqsA，mazE来源于大肠杆菌基因组，melA(AT00_02290)基因来源于海洋菌Pseudoalteromonas lipolytica SCSIO 04301基因组。通过与实施例1步骤(1)方法相同的酶切，连接，转化，得到重组质粒：pCA24N-mqsA，pCA24N-mazE和pCA24N-melA。
(2)采取与实施例2中相同的操作方法，检测重组质粒pCA24N-mqsA，pCA24N-mazE和pCA24N-melA在大肠杆菌中的稳定性。统计重组质粒与空质粒pCA24N分别在大肠杆菌中的稳定情况。
表4 大肠杆菌在不添加抗生素进行传代培养时胞内的质粒稳定性情况
质粒的稳定情况统计结果如表4所示。结果显示，本实施例中构建的重组质粒pCA24N-mqsA，pCA24N-mazE和pCA24N-melA与相应的空质粒相比稳定性没有显著性差异。可见，实施例2中抗毒素基因SO_1445增加质粒在宿主中的稳定性，并不是因为改变了质粒的结构引起。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 抗毒素SO_1445或其编码基因在提高质粒在宿主细胞中的稳定性中的应用
<160> 3
<210> 1
<211> 575
<212> DNA
<213> 希瓦氏菌MR-1
<400> 1
ataatgcttc tgcgacggta ttgagtgcta agtcagccat tagccaaacc ctataaacga 60
tagcggcatg tcgccgctat cgtttttatc cttattgcga ttagattgaa gattagcgtg 120
atgacggcgt aacattagtg cccagttaag cgatacaaac tatcttctat catccttgag 180
ctgatggcgt tgctcgagca gaaaagtaaa ccgagtaatc attatttttt tgtaccacgt 240
tatgctaagg tattacctag tagtactaag cattactttt ggagtcacag atgagcacaa 300
tcaaacccgt gtcggttaaa ttagatgccg atattaaagc cagagtcgag catttagcgg 360
aaacccgtaa acgttcatca cactggatga tgcgtgaagc gatccgtgaa tatgttgaga 420
gagaagagaa acgcgaagct ttgcagcaag aagcgttacg cgcatgggaa gaacaccaga 480
catcaggctt gcatgtcacc ggtgacgaag tggtgagttg gctggagtcc tggggaagtg 540
aaaatgaaca ggcagcccct acatgccaca aatag 575
<210> 2
<211> 285
<212> DNA
<213> 希瓦氏菌MR-1
<400> 2
atgagcacaa tcaaacccgt gtcggttaaa ttagatgccg atattaaagc cagagtcgag 60
catttagcgg aaacccgtaa acgttcatca cactggatga tgcgtgaagc gatccgtgaa 120
tatgttgaga gagaagagaa acgcgaagct ttgcagcaag aagcgttacg cgcatgggaa 180
gaacaccaga catcaggctt gcatgtcacc ggtgacgaag tggtgagttg gctggagtcc 240
tggggaagtg aaaatgaaca ggcagcccct acatgccaca aatag 285
<210> 3
<211> 94
<212> PRT
<213> 希瓦氏菌MR-1
<400> 3
Met Ser Thr Ile Lys Pro Val Ser Val Lys Leu Asp Ala Asp Ile
5 10 15
Lys Ala Arg Val Glu His Leu Ala Glu Thr Arg Lys Arg Ser Ser
20 25 30
His Trp Met Met Arg Glu Ala Ile Arg Glu Tyr Val Glu Arg Glu
35 40 45
Glu Lys Arg Glu Ala Leu Gln Gln Glu Ala Leu Arg Ala Trp Glu
50 55 60
Glu His Gln Thr Ser Gly Leu His Val Thr Gly Asp Glu Val Val
65 70 75
Ser Trp Leu Glu Ser Trp Gly Ser Glu Asn Glu Gln Ala Ala Pro
80 85 90
Thr Cys His Lys
94