检测PKLR基因突变的方法、试剂盒、寡核苷酸及其应用与流程

红细胞丙酮酸激酶是糖酵解途径的三个关键限速酶之一。其作用为催化磷酸烯酮式丙酮酸转化为丙酮酸，同时产生ATP为红细胞提供能量。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)有四种同工酶：L、R、M1、M2，其中R型存在于成熟的红细胞中，由PKLR基因编码。红细胞中的丙酮酸激酶遗传性缺乏可引起红细胞能量代谢异常，非球性细胞性溶血性贫血，其分子水平上则存在PKLR基因的突变。

PKLR基因位于1号染色体长臂2区1带，包含11个外显子，共编码574个氨基酸。PKLR基因突变是丙酮酸激酶缺乏症的重要原因。自1961年初次报道后，迄今为止国内外共发现200余例PKLR突变。PKLR的突变种类几乎遍布整个基因，其中最常见的突变为错义突变，包括美国和欧洲的热点突变1529G>A，南欧的热点突变1456C>T和亚洲的1468C>T。

到目前为止PKLR基因的突变是如何引起酶缺乏的机制尚未完全清楚，其可能原因有：部分突变位于丙酮酸激酶活性中心，改变了底物磷酸烯醇式丙酮酸的结合力；部分突变可能引起突变点附近的疏水性下降，影响K⁺与其结合，导致Km升高；少数位于C区的突变会使结构改变，减弱亚单位间连接，影响三聚体形成，从而降低丙酮酸激酶的活性。

丙酮酸激酶缺乏症的患者严重时在新生儿期即出现严重贫血、需要终生输血。目前临床以检测丙酮酸激酶活性的方法来诊断丙酮酸激酶缺乏症，但这受到多种因素的影响，所以无论对是患者还是对产前诊断来说，对PKLR基因进行全外显子测序都具有非常重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供检测PKLR基因突变的寡核苷酸，采用PCR技术，可用于快速检测丙酮酸激酶缺乏症患者体内的PKLR基因外显子突变情况。所述寡核苷酸包括至少一对扩增PKLR基因外显子的引物，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R，或PKLR-11F/PKLR-11R，其碱基序列为：

PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；

PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；

PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；

PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；

PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；

PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；

PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；

PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；

PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；

PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；

PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；

PKLR-10R：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；

PKLR-11F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；

PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA。

进一步地，所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，PKLR-1F：PKLR-1R、PKLR-2F：PKLR-2R、PKLR-3-4-5F：PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F：PKLR-6-7R、PKLR-8-9F：PKLR-8-9R、PKLR-10F：PKLR-10R，或PKLR-11F：PKLR-11R的比值均为1。

进一步地，M13F：M13R的比值为1。

进一步地，所述寡核苷酸在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。

本发明的目的还在于提供一种检测PKLR基因突变的方法，包括以下步骤：

(1)抽提样本中的基因组DNA；

(2)利用至少一对扩增引物对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；

(3)利用一对测序引物M13F和M13R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的碱基序列；

(4)将(3)中的碱基序列与PKLR基因野生型参考序列进行比较，确定突变位点是否存在，其中，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R，或PKLR-11F/PKLR-11R，其碱基序列为：

PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；

PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；

PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；

PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；

PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；

PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；

PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；

PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；

PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；

PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；

PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；

PKLR-10R：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；

PKLR-11F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；

PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，PKLR-1F：PKLR-1R、PKLR-2F：PKLR-2R、PKLR-3-4-5F：PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F：PKLR-6-7R、PKLR-8-9F：PKLR-8-9R、PKLR-10F：PKLR-10R，或PKLR-11F：PKLR-11R的比值均为1。

进一步地，M13F：M13R的比值为1。

进一步地，所述方法在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。

本发明的目的还在于提供一种检测PKLR基因突变的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR扩增反应液、测序体系反应液，其中，检测体系PCR扩增反应液包括至少一对扩增引物，所述测序体系反应液包括一对测序引物M13F和M13R，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R，或PKLR-11F/PKLR-11R，其碱基序列为：

PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；

PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；

PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；

PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；

PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；

PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；

PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；

PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；

PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；

PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；

PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；

PKLR-10R：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；

PKLR-11F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；

PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA；

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13R：AACAGCTATGACCATG。

进一步地，PKLR-1F：PKLR-1R、PKLR-2F：PKLR-2R、PKLR-3-4-5F：PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F：PKLR-6-7R、PKLR-8-9F：PKLR-8-9R、PKLR-10F：PKLR-10R，或PKLR-11F：PKLR-11R的比值均为1。

进一步地，M13F：M13R的比值为1。

进一步地，所述检测体系PCR扩增反应液还包括2×PCR Buffer、dNTPs和KOD FX DNA Polymerase。

进一步地，所述测序体系反应液还包括测序纯化液、牛小肠碱性磷酸酶、EDTA、无水乙醇、75％乙醇、HIDI和Bigdye Terminator V3.1。

进一步地，所述测序纯化液包括核酸外切酶I、牛小肠碱性磷酸酶。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。

进一步地，所述试剂盒在辅助检测丙酮酸激酶缺乏症中的应用。

进一步地，引物序列PKLR-1F和PKLR-1R是扩增PKLR基因第1号外显子序列的引物，引物序列PKLR-2F和PKLR-2R是扩增PKLR基因第2号外显子序列的引物，引物序列PKLR-3-4-5F和PKLR-3-4-5R是扩增PKLR基因第3、4和5号外显子序列的引物，引物序列PKLR-6-7F和PKLR-6-7R是扩增PKLR基因第6、7号外显子序列的引物，引物序列PKLR-8-9F和PKLR-8-9R是扩增PKLR基因第8、9号外显子序列的引物，引物序列PKLR-10F和PKLR-10R是扩增PKLR基因第10号外显子序列的引物，引物序列PKLR-11F和PKLR-11R是扩增PKLR基因第11号外显子序列的引物。

有益效果：(1)本发明设计了扩增PKLR基因全部11个外显子序列的引物，通过加接头，使所有7对引物的PCR产物均可以用一对测序引物进行测序，而现有的测序技术要对每种扩增产物设计特异性的测序引物，这就需要设计7条测序引物(单向测序)或14条测序引物(双向测序)，因此，本发明所述引物既能将所述PKLR全外显子序列都扩增出来，也保证无论这些外显子的何处位置发生突变，都不会出现漏检的情况；(2)在设计引物时，通过让PKLR基因的第3、4和5号外显子共用一对引物，让PKLR基因的第6和7号外显子共用一对引物，让PKLR基因的第8和9号外显子共用一对引物，显著降低扩增引物的数量，这也会降低扩增产物的数量，从而降低测序引物的数量，因而极大地降低检测成本；(3)本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳；(4)常用的荧光定量PCR法要针对PKLR基因全部11个外显子可能发生突变的众多突变位点设计多个探针，因此，在11个外显子中，假设每个外显子存在3个突变位点，则要设计33个探针，检测成本显著增加，而本发明通过给设计的扩增引物添加接头，仅需使用一对测序引物就可检测这33个突变位点以及还未被发现的其他突变类型，从而使得检测成本显著降低。

附图说明

图1为PKLR基因在染色体上的定位图。

图2为PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R、PKLR-11F/PKLR-11R的电泳图。

图3、4、5、6、7、8、9分别为样本1的PKLR基因第1、2、3/4/5、6/7、8/9、10、11号外显子野生型测序截图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。

实施例1

一种检测PKLR基因多态突变位点的寡核苷酸，该寡核苷酸是针对PKLR基因至少一个外显子所设计的，包括至少一对扩增引物，所述至少一对扩增引物选自PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R，或PKLR-11F/PKLR-11R，其碱基序列为：

PKLR-1F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGAAATGCCAGGAGATGA；

PKLR-1R：AACAGCTATGACCATGTTCACCCTCATTTTCCTCCTAT；

PKLR-2F：TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGGGTATGCTGAGAGACGAA；

PKLR-2R：AACAGCTATGACCATGAAGAAGCACCTCAAGAAATACCA；

PKLR-3-4-5F：TGTAAAACGACGGCCAGTGGGTTGCATCAGGGAATAAA；

PKLR-3-4-5R：AACAGCTATGACCATGGCCAAGGAGAAGGGAATGTG；

PKLR-6-7F：TGTAAAACGACGGCCAGTGACTATGGGTGGGTCGTTTCT；

PKLR-6-7R：AACAGCTATGACCATGCACCCACAGGTGTCCCTAAAA；

PKLR-8-9F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGTGGGTGTCAGAGAAGTAGC；

PKLR-8-9R：AACAGCTATGACCATGTGGCATTCTGTCTCTCCTGG；

PKLR-10F：TGTAAAACGACGGCCAGTGTGACACCTGGAACTGGAACA；

PKLR-10R：AACAGCTATGACCATGGACCACAGGAGAGAGGCAAG；

PKLR-11F：TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAGGCTGGTCTCAAACT；

PKLR-11R：AACAGCTATGACCATGATGAGAATGGGAGACTGTGGA。

所述寡核苷酸还包括一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT；

M13R：AACAGCTATGACCATG。

一种检测PKLR基因突变的试剂盒，包括检测体系PCR扩增反应液和测序体系反应液，其中，

检测体系PCR扩增反应液包括：2×PCR Buffer(10.0μL)；dNTPs(2mM)；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；PKLR基因11个外显子的上、下游引物PKLR-1F(10μM)、PKLR-1R(10μM)、PKLR-2F(10μM)、PKLR-2R(10μM)、PKLR-3-4-5F(10μM)、PKLR-3-4-5R(10μM)、PKLR-6-7F(10μM)、PKLR-6-7R(10μM)、PKLR-8-9F(10μM)、PKLR-8-9R(10μM)、PKLR-10F(10μM)、PKLR-10R(10μM)、PKLR-11F(10μM)、PKLR-11R(10μM)。

测序体系反应液包括：测序纯化液(核酸外切酶I:0.6U，牛小肠碱性磷酸酶:1.2U)；EDTA(125mM)；无水乙醇；75％乙醇；HIDI(高度去离子甲酰胺)；一对测序引物M13F(3.2μM)、M13R(3.2μM)；Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)。

优选地，该试剂盒还包括血液DNA抽提试剂。

优选地，该试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。阳性对照品为含有人PKLR基因外显子DNA的溶液，严禁反复冻融。阴性对照品为ddH₂O。空白对照品为2μl生理盐水或不加任何物质。

实施例2血液样本DNA抽提

血液样本DNA抽提(根据天根生物血液/细胞/组织基因DNA提取试剂盒说明书)：抽提人血液样本DNA，具体抽提方法如下：

(1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀；

(2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；

(3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

(5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

(6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

(8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液；

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2～5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

实施例3样本DNA扩增

按照实施例2抽提的血液样本DNA，然后利用实施例1中的扩增引物扩增人PKLR基因外显子，获得扩增产物。扩增时在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。详情如下所示：

(i)按样品数n(样品数＝待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个+空白对照1个)取测体系PCR扩增反应液，每管19μL分装于反应管中；

(ii)将上述处理好的待测样本和阴性对照品、阳性对照品各取1μL分别加入反应管中，混匀，低速离心数秒，进行PCR扩增，获得扩增产物。测体系PCR扩增反应液配制方法如表1所示。PCR扩增扩增反应条件如表2所示。每对扩增引物的详细信息如表3所示。

表1.测体系PCR扩增反应液配制

注：表中的PrimerF和PrimerR选自PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R，或PKLR-11F/PKLR-11R。

表2.PCR扩增反应条件

表3.每对扩增引物信息

实施例4 Sanger测序

取9μl实施例3中的扩增产物和2μl实施例1中的测序纯化液按照表4中所述的程序进行纯化，从而获得纯化产物。

表4纯化程序

将1μl所获得的纯化产物分别与实施例1中的测序引物M13F(3.2μM)、M13R(3.2μM)按照表5中的体系进行混合，然后按照表6中的测序反应程序进行测序。

表5

表6.测序反应程序

沉淀环节：

向完成测序反应的产物中加入2μl 125mM的EDTA，静置5min；加入15l无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50l 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性试验步骤为：95℃，5min；接着在-30℃2min，然后在4℃保存。

变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序。

结果判断：

分别将测序结果与PKLR野生型参考序列(Genbank accn：NC_000001.11)进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。

实施例5临床样本检测

取3例临床血液样本(样本编号为1～3)先后按照实施例1、实施例2、实施例3和实施例4，配制试剂、抽提样本DNA、扩增(获得扩增产物)和测序。每份样本往检测体系PCR反应液中加入1μl。

利用所获得的扩增产物，开展DNA电泳，电泳条件为1.5％琼脂糖凝胶电泳，110V，25min，凝胶成像系统观察。电泳结果如图2所示。

图2为这3例血液样本以PKLR-1F/PKLR-1R、PKLR-2F/PKLR-2R、PKLR-3-4-5F/PKLR-3-4-5R、PKLR-6-7F/PKLR-6-7R、PKLR-8-9F/PKLR-8-9R、PKLR-10F/PKLR-10R和PKLR-11F/PKLR-11R等7对扩增引物扩增后所得扩增产物的电泳图谱，M为Marker DL 2000，1～3为送检的血液样本编号1～3号。这6对引物扩增的片段长度分别为335bp、322bp、838bp、766bp、662bp、373bp、644bp，通过电泳图的分析表明这7对引物扩增有效，且条带单一。

在这3例样品中，以样本1为例进行详细说明。样本1的测序结果如图3-9所示。

图3显示是样本1的PKLR基因第1号外显子野生型测序截图，说明样本1的1号外显子未发生突变。

图4显示是样本1的PKLR基因第2号外显子野生型测序截图，说明样本1的2号外显子未发生突变。

图5显示是样本1的PKLR基因第3、4、5号外显子野生型测序截图，说明样本1的3、4、5号外显子未发生突变。

图6显示是样本1的PKLR基因第6、7号外显子野生型测序截图，说明样本1的6、7号外显子未发生突变。

图7显示是样本1的PKLR基因第8、9号外显子野生型测序截图，说明样本1的8、9号外显子未发生突变。

图8显示是样本1的PKLR基因第10号外显子野生型测序截图，说明样本1的10号外显子未发生突变。

图9显示是样本1的PKLR基因第11号外显子野生型测序截图，说明样本1的11号外显子未发生突变。

从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把PKLR基因共11个外显子序列包括在内了，能够扩展出PKLR基因全部11个外显子，并且测序结果完全准确。由检测结果可知，样本1的11个外显子均为野生型。另外，对PKLR基因外显子突变阳性样本的检测也表明本发明的寡核苷酸、方法和试剂盒能够检测出PKLR基因外显子突变的突变情况。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州艾迪康医学检验中心有限公司

<120> 检测PKLR基因突变的方法、试剂盒、寡核苷酸及其应用

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

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tgtaaaacga cggccagtag aggaaatgcc aggagatga 39

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aacagctatg accatgttca ccctcatttt cctcctat 38

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgtaaaacga cggccagtag agggtatgct gagagacgaa 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aacagctatg accatgaaga agcacctcaa gaaatacca 39

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgtaaaacga cggccagtgg gttgcatcag ggaataaa 38

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aacagctatg accatggcca aggagaaggg aatgtg 36

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<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgtaaaacga cggccagtga ctatgggtgg gtcgtttct 39

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aacagctatg accatgcacc cacaggtgtc cctaaaa 37

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgtaaaacga cggccagtgt gtgggtgtca gagaagtagc 40

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aacagctatg accatgtggc attctgtctc tcctgg 36

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgtaaaacga cggccagtgt gacacctgga actggaaca 39

<210> 12

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aacagctatg accatggacc acaggagaga ggcaag 36

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tgtaaaacga cggccagtgc caggctggtc tcaaact 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

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<210> 15

<211> 18

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<210> 16

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<213> 人工序列

<400> 16

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