本发明涉及基因工程和细胞学领域，具体涉及一种敲除aav受体的方法、敲除了aav受体的hek293细胞株及其应用。
背景技术：
：目前基因治疗从近几十年来无数科学家的梦想正逐步变成了现实。基因治疗的载体一直是整个基因治疗的关键，作为基因载体，需要具有安全性、有效性、特异性。多种病毒、非病毒载体经过多年的演变、淘汰，目前重组腺相关病毒(raav)载体是公认为符合以上三个标准的基因治疗载体。由于aav的生产得率长期以来提升缓慢，因而临床应用的普及程度也受此制约。随着近几年来第一个被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物glybera上市，sparktheraputics公司的治疗先天性失明的spk-rpe65三期临床表现优秀，aav作为基因治疗载体的方向与道路已完全被证明，但aav的生产效率仍是基因治疗的关键瓶颈。一个需要全身性转导的遗传疾病需要约1x1015aav基因组拷贝数(gc)的颗粒，而这个临床级别的生产量需要50万美元。生产上，如果用目前实验室能力范围内一次50个15cm盘可获得1x1013gc的生产效率来计算，则需要要生产100次或100倍的生产规模才能得到治疗一个病人的总量。目前aav的主流生产方法是三质粒转染hek293细胞方法。三质粒转染法简单、快速，但由于hek293为贴壁细胞，这种方法在规模上的扩展较有困难。但如果能把贴壁细胞驯化为悬浮细胞，则该方法会打破自身的局限，成为规模化工业生产的重要候选方案。把贴壁的hek293细胞驯化为悬浮细胞近几年已有人取得成功，但由于原本的生产效率仍是未能满足需求，因此规模化生产只能靠单一地增加生产规模。在常规的aav生产中，已有多篇报道发现了在大部分aav在hek293细胞生产aav过程中分泌到上清中。这一现象使目前的aav生产方法有了一定的变化，即不再忽略上清中存在的aav；并且还产生了一个新的aav生产方式：长时间培养三质粒转染后的hek293细胞，并连续地收集上清中的aav。这一方法据称可达到原先一次转染后三天收获aav的总量的5倍。但是，上清中的aav是由hek293细胞分泌出来，也会因为aav容易感染hek293细胞而再次进入hek293细胞中。感染进入hek293细胞后的aav会经历溶酶体的包含、消化外壳、aav基因组逃脱溶酶体等步骤，最终会导致已经生产、分泌出来的aav再次被回收，总aav产量变低。由此可见，现有技术生产aav的产量瓶颈亟待打破，在方法上改进、创新，取得更高的aav产率是目前基因治疗的一大亟待改善的问题。技术实现要素：有鉴于此，有必要针对的问题，提供一种敲除aav受体的方法、敲除了aav受体的hek293细胞株及其应用，可将aav感染hek293细胞这一途径阻断，提升aav的最终产量。本发明通过以下技术方案实现：一种敲除了aav受体的hek293细胞株(aavrkohek293)，编号arko-x88，保藏编号：cctccno：c201793；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)；保藏日期：2017年06月22日；分类命名：hek293人胚肾细胞arko-x88。所述aav受体为kiaa0319l，其基因位于染色体1p34.3，ncbireferencesequence:nm_024874.4，所述敲除了aav受体的hek293细胞株在常规培养条件下与原始的hek293细胞并无显著形态学差异，但在aav的产量上提高了约50％。一种通过crispr技术敲除hek293细胞的aav受体kiaa0319l的方法，步骤包括：(1)构建靶向aavr基因组序列的sgrna载体：设计基因的靶序列，利用sgrna克隆骨架载体pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna构建靶向aavr基因组序列的sgrna载体；(2)将(1)中的靶序列的sgrna载体分别转染293t细胞，再经培养得到各克隆细胞，稀释，分转到反应孔板中；(3)待(2)中的生长15天后得到单克隆；再消化，并用完全培养基中和，一半细胞悬液冻存，另一半细胞悬液提取基因组dna用于surveyor基因突变分析试验；(4)surveyor基因突变分析试验鉴定所提取的单克隆的基因组dna，确认aavr突变的单克隆，即为敲除了aav受体的293t细胞株；(5)复苏(3)中aavr突变的单克隆冻存细胞到反应孔板中，作aav生产的产量比较，选择出高产aav的aavr突变细胞株；(6)pcr测序全面鉴定(5)中所得高产aav的aavr突变hek293细胞株基因组中其它潜在突变位点的突变情况；(7)把(6)中鉴定无其它突变位点的细胞株再扩大，建库以备生产。进一步的，所述敲除hek293细胞的aav受体kiaa0319l的方法，步骤包括：(1)、构建靶向aavr基因组序列的u6启动子驱动下的sgrna载体：设计2个kiaa0319l基因的靶序列：ar1：gaggtgacacaatagcaatg(外显子8)ar2：ggtaggggtagcataactgt(外显子4)sgrna克隆骨架载体：pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna(来源于addgene的载体编号42230(px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9)，置换原cbh启动子为cmv启动子)；将所述靶序列分别克隆至所述骨架载体中；(2)将(1)中的两个不同的靶序列的载体分别转染293t细胞，转染方法：①转染前16小时分1e+5个293t细胞在24孔板孔中；②转染时把1μg载体dna和3ulpei在50uldmem中混匀静置15分钟，然后加入孔中，轻摇以保证均匀分布；③16小时后换为完全培养基，37度，5％co2条件下培养，3天后把各克隆细胞稀释到约2.5个细胞/ml，分到96孔板中，200ul/孔，以获得理论分配为0.5个细胞每孔，从而确保一个孔内绝大多数情况下为一个细胞长成的单克隆；；(3)待(2)中的生长15天后得到单克隆；用50ul0.01％trypsin胰酶消化克隆1分钟，用50ul完全培养基中和，取50ul细胞悬液提取基因组dna作后面surveyor基因突变分析试验；剩余的50ul细胞悬液加入含有10％dmso的完全培养基250ul，冻存-80度超低温冰箱；(4)surveyor基因突变分析试验鉴定所提取的单克隆的基因组dna，选出aavr突变的单克隆，即敲除了aav受体的293t细胞株；默认步骤(3)中冻存的另一半细胞液与该步骤鉴定结果相同；(5)再复苏(3)中已确认为aavr突变的单克隆冻存细胞到6孔板中，扩大培养至3x106个细胞/孔(密度约80～90％)，每孔冻存2.5x106个细胞，每孔剩余的0.5x106个细胞分到24孔板的一个孔中，作aav生产的产量比较，具体操作方法为：通过常规三质粒共转染，将腺病毒辅助载体pad-deltaf6、aavdj血清型辅助载体prc-dj、载体pitr-cag.egfp共转染293t细胞突变株细胞，同时以常规293t细胞作为平行转染对照；转染3天后收获细胞及上清，经三次冻融后离心取上清，稀释1000倍后取2ul，在20ul的总反应体系(15.8μlh2o，2μl10xdnase缓冲液，dnasei(70u/ul)0.2μl)中用dna酶消化(37℃条件下30分钟)，去除残余的质粒dna；再稀释10倍后用sybrgreenqpcr方法分析aav-egfp产量；与常规293t细胞对照相比，选择出高产aav的aavr突变细胞株；(6)pcr测序全面鉴定(5)中的高产aav的aavr突变hek293细胞株基因组中其它潜在突变位点的突变情况；(7)把(6)中所得的无其它突变位点的细胞株再扩大，建库以备生产。进一步的，所述敲除了aav受体的hek293细胞株在aav生产领域的应用。一种利用敲除了aav受体的hek293细胞株制备aav的方法，具体操作步骤包括：(1)、铺敲除了aav受体的hek293细胞株至反应孔板中；(2)、将prc-dj载体、ad辅助载体及aav-egfp载体加入dmem中，再加入pei(1ug/ul)，马上混匀，培养；(3)、培养72小时后收集细胞和上清，反复冻融三次，离心得上清即为aav粗提液。进一步的，所述利用敲除了aav受体的hek293细胞株制备aav的方法，具体操作步骤包括：(1)、铺敲除了aav受体的hek293细胞株()约3x105至24孔板中，16小时后转染时细胞密度约为60～70％；(2)、用prc-dj与ad辅助载体及aav-egfp载体各0.2～2ug，加入0.5mldmem中，再加入pei15ul(1ug/ul)，马上混匀，常温下放置10分钟后加入细胞培养基中再放回37度细胞培养箱(5％co2浓度)培养；(3)、培养72小时后收集细胞和上清，在37℃水浴和干冰-乙醇浴中反复冻融三次(解冻与冻结每次各2分钟)，10000g离心10分钟后上清为aav粗提液。本发明有益效果：本发明的敲除了aav受体的hek293细胞株(aavrkohek293)，所述受体kiaa0319l(aavr)一旦被敲除，细胞基本不能被任何血清型的aav所感染。本发明从这一理论出发，旨在获得一种敲除了aav受体(aavr)的hek293细胞株，把aav感染hek293细胞这一途径阻断，减少生产过程中aav的损失，从而得到比常规hek293细胞产量高出约50％的敲除了aav受体(aavr)的hek293细胞株(aavrkohek293)，提升aav的最终产量，大幅降低生产规模与成本。附图说明图1为本发明aavrkohek293细胞与常规hek293细胞的aav生产率对比图。保藏信息：保藏编号：cctccno：c201793；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)；地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学第一附小对面；保藏日期：2017年06月22日。具体实施方式为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本
发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。实施例一本发明的aav受体敲除的hek293细胞株及其制备方法1、本发明的敲除了aav受体的hek293细胞株在常规的hek293细胞生产aav过程中，aav会分泌到上清液中，上清中的aav容易感染hek293细胞而再次进入hek293细胞中，感染进入hek293细胞后的aav会经历溶酶体的包含、消化外壳、aav基因组逃脱溶酶体等步骤，最终会导致已经生产、分泌出来的aav再次被回收，总aav产量变低。kiaa0319l(后称aavr)是aav感染细胞的必要受体，该受体处于细胞膜表面，基因位于染色体1p34.3，ncbireferencesequence:nm_024874.4，该受体kiaa0319l(aavr)一旦被敲除，细胞基本不能被任何血清型的aav所感染。根据这一理论，本发明提供一种敲除了aav受体的hek293细胞株。该细胞株编号arko-x88，生长形态与常规293t无明显差异。经大规模aav生产验证，相比常规293t细胞产率高出约50％。2、本发明的敲除了aav受体的hek293细胞株的无筛选压力制备方法通过crispr技术以无筛选压力法敲除hek293细胞的aav受体kiaa0319l的方法，步骤包括：(1)、构建靶向aavr基因组序列的u6启动子驱动下的sgrna载体。具体操作如下：(1.1)设计2个kiaa0319l基因的靶基因序列及引物：靶基因：ar1：gaggtgacacaatagcaatg(外显子8)ar2：ggtaggggtagcataactgt(外显子4)引物：ar1-sgrna-fcaccgaggtgacacaatagcaatgar1-sgrna-raaaccattgctattgtgtcacctcar2-sgrna-fcaccggtaggggtagcataactgtar2-sgrna-raaacacagttatgctacccctacc(1.2)退火：把引物分别稀释到100um，再将ar1-sgrna-f与ar1-sgrna-r，ar2-sgrna-f与ar2-sgrna-r分别按以下体积混匀：试剂用量f(100um)1ul(final10um)r(100um)1ul(final10um)10xt4连接反应液(takara公司)1ul无核酸酶水6.5ult4pnk(10u/ul，takara公司)0.5ul(final5u)总量:10ul37度反应30分钟后整体转移至装满250ml水的烧杯中，烧开水3分钟后自然冷却到常温。(1.3)用pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna(来源于addgene的载体编号42230(px330-u6-chimeric_bb-cbh-hspcas9)，置换原cbh启动子为cmv启动子)作为骨架作酶切连接载体：酶切连接反应试剂用量pg-cmv.spcas9-u6.(sp)sgrna25ng10um退火产物1ul10xt4连接反应液1ulh2o加到9ulbbsi(5u/ul)0.5ul(2.5u)t4连接酶(400u/ul)0.5ul(200u)总量10ul反应条件:1)37摄氏度，5分钟；2)23摄氏度，5分钟；3)转到步骤1)，20-30个循环，4小时。(1.4)转化：各取5ul连接产物转化50uldh5a感受态细胞，常规转化方法。(1.5)测序：挑克隆作小量质粒提取后，用u6启动子引物测序鉴定靶序列是否已经克隆进入载体中。(2)将(1)中得到的两个靶序列的sgrna载体分别转染293t细胞(293t，crl-3216tm，用含10％胎牛血清、2mml-glutamine(atcc30-2214)、1％penicillin/streptomycin的高糖dmem(称为完全培养基)培养)。转染方法如下：①转染前16小时分1e+5个293t细胞在24孔板孔中；②转染时把1μg载体dna和3ulpei在50uldmem中混匀静置15分钟，然后加入孔中，轻摇以保证均匀分布；③16小时后换为完全培养基，37度，5％co2条件下培养，3天后把各克隆细胞稀释到约2.5个细胞/ml，分到96孔板中，200ul/孔，以获得理论分配为0.5个细胞每孔，从而确保一个孔内绝大多数情况下为一个细胞长成的单克隆；(3)生长15天后得到长成一定细胞数量的单克隆，共获得91个单克隆，编号arko-x1～91。再进一步鉴定克隆是否已被敲除aavr：用50ul0.01％trypsin胰酶消化克隆1分钟，再加50ul完全培养基中和，取50ul细胞悬液提取基因组dna(qiagenqiaampdnaminikit，货号catno./id:51306)作后面surveyor基因突变分析试验；剩余的50ul细胞悬液加入含有10％dmso的完全培养基250ul，冻存-80度超低温冰箱。(4)surveyor基因突变分析试验鉴定所提取的单克隆arko-x1～91的基因组dna，选出aavr突变的单克隆(详细步骤见mutationdetectionkit检测试剂盒说明书，货号706020)，确认敲除了aav受体的293t细胞株32个，突变率35.2％。因为绝大部分96孔板中一孔的细胞是单个细胞繁殖而来，默认其基因型是一致的，因此可得出另一半冻存细胞的基因型与本步骤验证的结果一致。(5)从先前96孔板冻存的细胞复苏被确认为aavr突变的单克隆冻存细胞到6孔板中，扩大培养至3x106个细胞/孔(密度约80～90％)，再每孔冻存2.5x106个细胞，每孔剩余0.5x106个细胞分到24孔板的一个孔中，作aav生产的产量比较。通过常规三质粒共转染：腺病毒辅助载体pad-deltaf6(载体来源：美国宾夕法尼亚大学载体部upennvectorcorepl-f-pvadf6)，aavdj血清型辅助载体prc-dj(载体来源：在来源于美国宾夕法尼亚大学载体部upennvectorcore的paav2/2基础上，用根据公开的aav-dj的序列替换aav2cap2序列合成而来)、能在广谱启动子cag驱动下表达绿色荧光蛋白的带itr目的载体pitr-cag.egfp(载体来源：来源于美国宾夕法尼亚大学载体部upennvectorcore的pl-c-pv1045pennaavcb6pimaster，用常规的克隆方法插入egfp蛋白编码构建而成)共转染293t细胞突变株细胞，同时以正常293t细胞作为平行转染对照。转染3天后收获细胞及上清，经三次冻融后离心取上清，稀释1000倍后取2ul，在20ul的反应体系(包括：15.8μlh2o，2μl10xdnase缓冲液，dnasei(70u/ul)0.2μl)中用dna酶消化(反应条件：37℃条件下30分钟)，去除残余的质粒dna。再稀释10倍后用sybrgreenqpcr方法分析aav-egfp产量。与常规293t细胞对照相比，选择出5株高产aav的aavr突变细胞株，进一步用更大规模aav生产验证其高产率。(5)pcr测序鉴定高产aav的aavr突变hek293细胞株基因组中有较大机率突变的相似序列位点(只限于近3’端17bp中有2个位点突变)情况：设计pcr引物(见表1)扩增相应靶点的潜在脱靶区域，测序确认有无突变。表1：引物列表(6)把无其它突变位点的细胞株再扩大，建库以备生产。实施例二本发明的aav受体敲除的hek293细胞株制备aav利用aav受体敲除的hek293细胞株制备aav的方法，具体操作步骤包括：利用本发明细胞株arko-x88，采用常规的aav生产方法，即如下：1、铺arko-x88细胞约3x105至24孔板中，第二天转染时细胞密度约为60～70％；2、用aav辅助载体prc-dj(载体来源：在来源于美国宾夕法尼亚大学载体部upennvectorcore的paav2/2基础上，用根据公开的aav-dj的序列替换aav2cap2序列合成)与ad辅助载体pad-deltaf6(载体来源：美国宾夕法尼亚大学载体部upennvectorcorepl-f-pvadf6)及重组aav载体pitr-cag.egfp(载体来源：来源于美国宾夕法尼亚大学载体部upennvectorcore的pl-c-pv1045pennaavcb6pimaster，用常规的克隆方法插入egfp蛋白编码构建而成)各0.2～2ug，加入0.5mldmem中，再加入pei1～5ul(1ug/ul)，马上混匀，常温下放置10分钟后加入细胞培养基中，再放回37度细胞培养箱(5％co2浓度)培养；3、培养72小时后收集细胞和上清，在37℃水浴和干冰-乙醇浴中(干冰+乙醇可快速冻结液体及细胞，更有利于破裂细胞，释放出aav颗粒)中往返冻融三次(解冻与冻结每次各2分钟)，10000g离心10分钟后上清为aav粗提液。对照试验：用未敲出aav受体的hek293细胞制备aav的方法1、铺hek293细胞约3x105至24孔板中，第二天转染时细胞密度约为60～70％。2、用aav辅助载体prc-dj与ad辅助载体pad-deltaf6及重组aav载体pitr-cag.egfp载体各0.2～2ug，加入0.5mldmem中，再加入pei1～5ul(1ug/ul)，马上混匀，常温下放置10分钟后加入细胞培养基中，再放回37度细胞培养箱(5％co2浓度)培养。3、72小时后收集细胞和上清，在37℃水浴和干冰-乙醇浴中中往返冻融三次(解冻与冻结每次各2分钟)，10000g离心10分钟后上清为aav粗提液。本发明aavrkohek293细胞与常规hek293细胞的aav生产率对比见图1。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12