一种猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重PCR检测引物对及试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法，具体涉及猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物对及试剂盒。

背景技术：

猪圆环病毒是pcv-2为主要病原，且在全世界分布广泛，为威胁世界养猪业的重要病原之一。pcv-2感染后会出现断奶仔猪多系统消耗综合征(pmws)、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍症。2016年，美国学者phan利用高通量的方法对暴发皮炎肾病综合征(pdns)的母猪进行检测，发现一种新的圆环病毒亚型pcv-3。后也在中国发现该病毒的存在，且阳性率较高，为34.7％。猪伪狂犬病毒(prv)可引起猪多种急性传染病，以发热和脑脊髓炎为主要特征，新生仔猪出现神经症状，妊娠母猪表现为流产、死胎、木乃伊胎等。

随着我国养殖业不断走向现代化养殖模式的超大规模化养殖场，新型病毒的发现及混合感染，给养猪业造成巨大经济损失。而多重pcr是在常规pcr的基础上发展起来的，不仅保留常规pcr特异性强、灵敏度高的优点，而且可在同一体系中加入多对引物扩增多个病原的目的基因，具有可极大的减少操作步骤和时间，节省试剂，能够对疾病做到快速、准确诊断，适合大量临床样品，尤其是混合感染样品中多种病原体的快速检测，现已应用于多种病原体的检测。因此，建立猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物对及试剂盒十分必要。本发明根据猪伪狂犬病毒gh基因、猪圆环病毒2型orf2基因和猪圆环病毒3型orf2基因设计引物组，可用于建立高效、准确、快速的分子生物学诊断技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种高敏感性、特异性和准确性的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物组及试剂盒。

本发明的技术方案之一是提供一种猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物组，所述引物组由三对引物组成，

其中，猪伪狂犬病毒的检测引物对，由seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:2所示的核苷酸序列的反向引物组成；

猪圆环病毒2型的检测引物对，由seqidno:3所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:4所示的核苷酸序列的反向引物组成；

猪圆环病毒3型的检测引物对，由seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:6所示的核苷酸序列的反向引物组成。

在本发明的实施例中，所述引物组的退火温度为52℃。

本发明提供的引物组用于扩增猪伪狂犬病毒gh基因、猪圆环病毒2型orf2基因和猪圆环病毒3型orf2基因的部分片段，扩增的目的基因片段大小分别为356bp、248bp和408bp。

本发明的技术方案之二是，提供一种猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测试剂盒，包括猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物组，所述引物组由三对引物组成，

其中，猪伪狂犬病毒的检测引物对，由seqidno:1所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:2所示的核苷酸序列的反向引物组成；

猪圆环病毒2型的检测引物对，由seqidno:3所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:4所示的核苷酸序列的反向引物组成；

猪圆环病毒3型的检测引物对，由seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物和seqidno:6所示的核苷酸序列的反向引物组成。

在本发明的实施例中，所述seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物的浓度均为10μmol/l，所述seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物的浓度均为10μmol/l。

作为优化的技术方案，本发明提供的试剂盒还包括takaraextaq、10×extaqbuffer、dntpmixture、ddh2o、阴性质控品和阳性质控品。

优选地，所述的阴性质控品为ddh2o；所述阳性质控品为猪伪狂犬病毒的阳性质粒、猪圆环病毒2型的阳性质粒和猪圆环病毒3型的阳性质粒。

本发明提供的试剂盒的使用方法包括以下步骤：以待测样品的dna为模板，在具有如所述seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物和所述seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物的存在下，经过多重pcr检测，根据检测结果判断猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的存在情况及混合感染情况。

在本发明的实施例中，所述seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物的浓度均为10μmol/l，和所述seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物的浓度均为10μmol/l。

在本发明实施例中，所述猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测的反应体系为25μl，该反应体系包括：

(1)10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl；

(2)待测样品的dna模板2.5μl；

(3)takaraextaq0.3μl；

(4)10×extaqbuffer2.5μl；

(5)dntpmixture1μl；

(6)ddh2o12.7μl。

在本发明实施例中，所述猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型多重pcr检测的扩增程序为：

(1)94℃预变性5min；

(2)94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，进行36个循环；

(3)72℃延伸7min。

本发明的有益效果是：本发明提供的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物组及试剂盒，所述引物组包括三对引物(包括seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)。所述引物组用于扩增猪伪狂犬病毒gh基因、猪圆环病毒2型orf2基因和猪圆环病毒3型orf2基因的部分片段，扩增的目的基因片段大小分别为356bp、248bp和408bp。本发明还提供猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测试剂盒及该试剂盒的使用方法。应用本发明所述的引物组通过多重pcr检测对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型进行检测，检测结果为阳性，其他猪相关病毒为阴性，检测的特异性强。应用本发明的引物组进行多重pcr检测的灵敏度高，达到1.0×10³拷贝/μl。可同时用于猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的检测。

附图说明

图1为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr扩增结果电泳图；其中，1：prv单重pcr扩增产物；2：pcv-2单重pcr扩增产物；3：pcv-3单重pcr扩增产物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr扩增产物；5：阴性对照；m：dnamarkerdl2000；

图2为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr特异性试验结果电泳图；其中，1：prv单重pcr扩增产物；2：pcv-2单重pcr扩增产物；3：pcv-3单重pcr扩增产物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr扩增产物；5-9自左向右依次为：pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv的扩增产物；10：阴性对照；m：dnamarkerdl2000；

图3为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr敏感性试验结果电泳图；其中，1-8自左向右依次为：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μl检测浓度的pcr扩增产物；9：阴性对照；m：dnamarkerdl2000；

图4为猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr重复性试验结果电泳图；其中a、b和c分别代表第一周、第二周和第三周的pcr扩增结果电泳图；1：prv单重pcr扩增产物；2：pcv-2单重pcr扩增产物；3：pcv-3单重pcr扩增产物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr扩增产物；m：dnamarkerdl2000。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，最佳实施例不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明所涉及的实验材料来源如下，其他未说明的材料均为普通市售品，均可通过市场购买获得：

1、菌株和质粒

大肠杆菌top10感受态细胞购自北京天根生化科技有限公司。

pcv-3(猪圆环病毒3型)、pcv-2(猪圆环病毒2型)、prv(猪伪狂犬病毒)、csfv(猪瘟病毒)、prrsv(猪繁殖与呼吸综合征病毒)、pedv(猪流行性腹泻病毒)、pdcov(猪丁型冠状病毒)和tgev(猪传染性胃肠炎病毒)均从江西各猪场临床样品中分离获得并由本实验室保存。

2、试剂

酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素均购自北京索莱宝科技有限公司；

病毒rna/dna提取试剂盒(离心柱型)、takaraextaq、10×extaqbuffer、dntpmixture、dl2000dnamarker、pmd18-t载体均购置takara(大连)公司；

质粒小提试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；

胶回收试剂盒购自omega公司。

3、设备

sorvallst16r高速冷冻离心机、legendmicro21r高速冷冻离心机和nanodrop2000均购自美国thermo公司；

appliedbiosystems7500pcr仪购自美国应用生物系统公司；

琼脂糖水平电泳槽购自北京六一生物科技有限公司；

凝胶成像系统购自上海培清科技有限公司。

实施例1：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型多重pcr检测方法建立

1、引物设计与合成

根据genbank中登陆的prv(ku057086)hb1201毒株的gh保守区域、pcv-2(kx814348)ay4844毒株的orf2保守区域和pcv-3(kx966193)pcv3-us/sd2016毒株的orf2保守区域，应用primerpremier5.0软件设计三对特异性引物，引物由上海生工生物工程技术服务公司合成，所得的引物组的序列如表1所示(其中，“f”代表正向引物，“r”代表反向引物)：

表1：引物信息

2、病毒dna提取

根据takara公司的minibestviralrna/dnaextractionkitver.5.0病毒提取试剂盒的操作说明书分别提取prv、pcv-2和pcv-3病毒的rna/dna，操作步骤如下：

(1)研磨器研磨样品后，离心取上清；

(2)取200μl离心后上清、200μlbuffervgb、20μl蛋白酶k和1μlcarrierrna混匀，于56℃水浴10min；

(3)裂解后的液体加入200μl无水乙醇混匀，转移至spincolumns，离心后分步加入bufferrwa/rwb，离心。

(4)离心后加入30μl无rnaaseddh2o溶解dna/rna，-80℃保存备用。

3、pcr扩增

分别以上一步提取的prv的基因组dna、pcv-2的基因组dna、pcv-3的基因组dna，以及prv、pcv-2和pcv-3的混合基因组dna(按prv、pcv-2和pcv-3的体积比为1:1:1配制)为模板，按下述的反应体系和反应程序分别进行扩增：

该pcr检测的反应体系为25μl，包括：

(1)10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl；

(2)待测样品的dna模板2.5μl；

(3)takaraextaq0.3μl；

(4)10×extaqbuffer2.5μl；

(5)dntpmixture1μl；

(6)ddh2o12.7μl。

在本发明实施例中，所述猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒多重pcr检测的扩增程序为：

(1)94℃预变性5min；

(2)94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，进行36个循环；

(3)72℃再延伸7min。

pcr产物2％琼脂糖凝胶电泳观察电泳结果，电泳结果见图1，图中，1：prv单重pcr扩增产物；2：pcv-2单重pcr扩增产物；3：pcv-3单重pcr扩增产物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr扩增产物；5：阴性对照；m：dnamarkerdl2000。

结果说明：从图1可以看出，以prv、pcv-2和pcv-3的混合基因组dna为模板的多重pcr扩增产物的目的基因片段大小分别为248bp、356bp和408bp，与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型目的片段的长度一致。

实施例2：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法优化

使用50℃，52℃，54℃，56℃的温度梯度对反应进行优化，通过优化反应条件，确认以下的反应体系和扩增程序为最佳条件：

最佳反应程序：25μl的反应体系，包括：

(1)10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl；

(2)待测样品的dna模板2.5μl；

(3)takaraextaq0.3μl；

(4)10×extaqbuffer2.5μl；

(5)dntpmixture1μl；

(6)ddh2o12.7μl。

最佳扩增程序为：

(1)94℃预变性5min；

(2)94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸35s，进行36个循环；

(3)72℃再延伸7min。

实施例3：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测试剂盒制备

本发明提供的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测试剂盒，包括：takaraextaq、10×extaqbuffer、dntpmixture、ddh2o、引物组(包括如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)、阴性质控品(ddh2o)、阳性质控品(制备的标准质粒)。

本试剂盒制备过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司(takara)，其余购自天根生化科技(北京)有限公司、北京化工厂。所述试剂盒的制备过程如下：

1、pcr反应液制备

(1)引物设计与合成

根据genbank已发表的prvgh基因序列、pcv-2的orf2基因序列和pcv-3的orf2基因序列，用mega6.0软件进行序列比对找出保守序列。根据保守序列用primerpremier5.0软件设计多重pcr检测引物组，该引物组包括三对引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成，得到seqidno:1-6所示核苷酸序列的引物组。

(2)引物的溶解

取合成好的引物组(具有如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)干粉管，12,000rpm离心1min，按照引物溶解说明书加入ddh2o将干粉溶解，使上述3对引物，共6种引物的浓度各为10μm，振荡混匀离心，备用；

(3)pcr反应液配制

按下述比例配制pcr反应液：10μmol/l的seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物各1μl，和10μmol/l的seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物各1μl，takaraextaq0.3μl、10×extaqbuffer2.5μl、dntpmixture1μl。

2、阴性质控品制备

阴性质控品的作用是用来防止因污染而产生的假阳性。本发明采用ddh2o作为阴性质控品，对整个实验过程进行监控。

3、阳性质控品制备

阳性质控品的作用是监控试剂是否失效及性能是否下降。本发明采用阳性重组质粒作为阳性质控品。按照本技术领域中常用的分子克隆技术，阳性重组质粒的构建和提取方法如下：

首先利用seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物对提取的基因组dna进行pcr扩增；然后采用omegagelextractionkit回收pcr产物作为目的片段；采用大连宝生物的pmd18-tcloningvector试剂盒，将上述目的片段插入pmd18-t载体中，构建重组质粒，通过转化及筛选，得到含插入有上述目的片段的重组质粒的阳性克隆菌；该阳性克隆菌经过扩大培养后，用天根质粒提取试剂盒提取培养菌液中的质粒并用紫外分光光度计进行定量。

4、质控标准：

阴性质控品：阴性；

阳性质控品：阳性。

以上条件应同时满足，否则，此次试验视为无效，全部试验应重新进行。

5、分析判断：

pcr产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，有大小相符的条带，则为阳性，两条或者三条符合大小的电泳条带，则判断为混合感染，没有条带则说明没有猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的感染。

实施例4：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法特异性试验

利用本发明建立的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法分别以prv、pcv-2、pcv-3、pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv的基因组dna以及prv、pcv-2和pcv-3的混合基因组dna为模板进行pcr扩增，结果见图2；图中，1：prv单重pcr扩增产物；2：pcv-2单重pcr扩增产物；3：pcv-3单重pcr扩增产物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr扩增产物；5-9自左向右依次为：pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv的扩增产物，10：阴性对照；m：dnamarkerdl2000。

结果说明：应用本申请提供的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法对pdcov、pedv、tgev、prrsv、csfv病毒的检测结果均为阴性，只有猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的pcr检测结果呈阳性，表明该多重pcr检测方法的特异性良好。

实施例5：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法敏感性试验

首先利用引物组(具有如seqidno:1、seqidno:3、seqidno:5所示核苷酸序列的正向引物，和seqidno:2、seqidno:4、seqidno:6所示核苷酸序列的反向引物)对提取的prv、pcv-2和pcv-3的混合基因组dna为模板进行pcr扩增；然后采用omegagelextractionkit回收pcr产物作为目的片段；采用大连宝生物的pmd18-tcloningvector试剂盒，将上述目的片段插入pmd18-t载体中，构建重组质粒，通过转化及筛选，得到含插入有上述目的片段的重组质粒的阳性克隆菌；该阳性克隆菌经过扩大培养后，用天根质粒提取试剂盒提取培养菌液中的质粒，提取方法为：将200μlpcr鉴定为阳性且测序结果正确的菌液接种于20ml加有氨苄青霉素的lb液体培养基中，培养8h后，12000rpm离心2min，弃上清；加入2mlpbs重悬，12000rpm离心2min，弃上清后参照质粒小提试剂盒说明书(北京天根)提取质粒，提取后通过超微量分光光度计nanodrop2000测定提取的重组质粒的浓度，再根据重组质粒分子质量和阿伏伽德罗常数将质粒浓度换算成单位体积分子拷贝数，并将重组质粒以1.0×10⁸拷贝/μl为原始浓度后进行10倍梯度稀释，分别以1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μl为模板进行多重pcr扩增以检验本发明提供的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法的灵敏度，检测结果见图3，图中，1-8自左向右依次为：1.0×10⁸、1.0×10⁷、1.0×10⁶、1.0×10⁵、1.0×10⁴、1.0×10³、1.0×10²、1.0×10¹拷贝/μl检测浓度的pcr扩增产物；9：阴性对照；m：dnamarkerdl2000。

结果表明：本发明提供的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法的最低检测量为1.0×10³拷贝/μl，表明所建立的pcr方法敏感性良好。

实施例6：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法重复性试验

利用本发明所述的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法，分别以提取的prv的基因组dna、pcv-2的基因组dna、pcv-3的基因组dna，以及prv、pcv-2和pcv-3的混合基因组dna(体积比为1:1:1)为模板，进行三次扩增(间隔一周)，以确定检测结果的重复性，结果见图4，其中a、b和c分别代表第一周、第二周和第三周的pcr扩增结果电泳图；1：prv单重pcr扩增产物；2：pcv-2单重pcr扩增产物；3：pcv-3单重pcr扩增产物；4：prv、pcv-2和pcv-3的多重pcr扩增产物；m：dnamarkerdl2000。

结果说明：利用本发明所述的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法在不同时间点进行测定，测定结果一致，表明本发明所述的方法重复性良好。

实施例7：猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法对临床样品的检测

利用本发明所述的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法对采自江西32个猪场256份样品(肺、淋巴结、脾脏)进行检测，以验证该方法的实用性。结果prv有104份为阳性，pcv-2有212份为阳性，pcv-3有2份检测样品呈阳性。

结果表明：本发明所述的猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测方法在临床实践上具有可行性。

sequencelisting

<110>江西农业大学

<120>一种猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型和猪圆环病毒3型的多重pcr检测引物对

及试剂盒

<130>1

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gcgtgtactgcgactgcgtgt21

<210>2

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

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atggtatggcgggaggagta20

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<212>dna

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tggtgccgtagaaatctgtc20

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcctaaacgaatgggaaact20