4] 图5是本发明的GhGL3启动子序列（SEQ ID No. 2)与GaGL3启动子的序列比对分 析图谱；
[0035] 图6是本发明的GhGL3启动子序列（SEQ ID No. 2)与GrGL3启动子的序列比对分 析图谱。
【具体实施方式】
[0036] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照 附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0037] 本发明公开了一种GhGL3基因启动子，它们具有如SEQ ID No. 1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。与此同时，本发明还公开了一种启动子的载体，例如 pBIlOL 2-GhGL3pro ::⑶S载体，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
[0038] 本发明提供的是GhGL3基因启动子，具有如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的 核苷酸序列，或者是将SEQ ID No. 1的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添 加且具有与SEQ ID No. 1的核苷酸序列相同活性的由SEQ ID No. 1衍生的启动子。是下列 核苷酸序列之一：
[0039] (I)SEQ ID No. 1 的核苷酸序列；
[0040] (2)与SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列具有75%以上同源性。
[0041] SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列由4320个碱基组成，扩增GhGL3启动子中任一片 段的引物对也在本发明的保护范围之内，其中，上游引物和下游引物之间的距离在GhGL3 基因启动子的第1碱基到第4320个碱基之间，优选在第2313碱基到第4320个碱基之间； 该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。
[0042] 本发明所提供的启动子可以引导外源基因在棉花等植物中表达，将获得使某目的 基因在棉花纤维中表达的转基因细胞系及转基因植株。
[0043] 本发明的启动子在构建到植物表达载体中时，在其转录起始后可加上任何一种基 因的编码序列或任何一种增强子。
[0044] 为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加 工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。
[0045] 携带有本发明启动子的表达载体可通过使用基因枪、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒 载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主 既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。
[0046] 当本发明的启动子被用于目的基因在棉纤维中特异表达或改变棉花纤维数量、质 量性状时，可采用以下方法：1、将本发明的启动子克隆到植物转化载体中，在其后接上目的 基因的编码序列；2、将所构建的植物转化载体转化可再生棉花组织（或器官）并使本发明 启动子在转化的组织中表达；3、将被转化的组织（或器官）培养成植株。
[0047] 下面通过实施例来对本发明进行进一步地说明。
[0048] 实施例中所用的植物材料满足以下条件：
[0049] 在棉花花期，挂牌观察开花时间，采集叶片、花苞、花蕾、花和幼铃等于冰浴中带回 到实验室中，用灭菌的器具迅速分别采集花前1-3天、开花当天（0天）和花后1-5天的胚 珠，分为两部分。一部分用于染色观察，一部分于液氮中速冻，_80°C保存备用。
[0050] 实施例1棉纤维特异启动子的克隆
[0051] 棉纤维特异启动子的克隆采用Clontech公司试剂盒（GenomeWalker? Universal Kit，货号#638904)中所述的方法。
[0052] 棉花基因组DNA的提取按Paterson et al. (1993)的方法进行。取2.5 μ g基因 组 DNA，分别用 EcoR V、Dra I、Hpa I、Pvu II、Sac I、Sma I 和 Stu I (Takara 产品）酶切 过夜（16?18小时）。取5 μ 1酶切产物经0. 6%琼脂糖溴化乙锭（EB)凝胶电泳检测酶切 是否完全。如果酶切完全，加入等体积的Tris饱和酚和氯仿进行抽提，并用冰上预冷95% 乙醇（含有3M醋酸钠和20 μ g糖原）沉淀，用冰上预冷80%乙醇洗沉淀，最后将沉淀溶于 25 μ I TE(10mM Tris/0,1mM EDTA，ρΗ7· 5)中。取1 μ 1酶切产物经0· 6%琼脂糖溴化乙锭 (EB)凝胶电泳检测酶切产物的纯度。
[0053] 将纯化的七种酶切DNA各取4 μ 1，再分别加入L 9 μ I Genomic Walker Adaptor 基因组步移接头序列（25μΜ)，1·6μ I IOXligation buffer连接缓冲液，0·5μ I T4 DNA Iigase连接酶（6U/yl，购自Clontech)，16°C连接过夜；70°C加热5分钟终止反应；在各管 中加入 72μ1 TE(10mM Tris/lmM EDTA，pH7.5)，即为七个酶切 DNA 文库：EcoR V、Dra I、 Hpa I、Pvu II、Sac I、Sma I 和 Stu I。
[0054] Genome Walker Adaptor 为：
[0055] 5 ' -GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3，
[0056] 3, -H2N-CCCGACCA-P04-5'
[0057] 本方案根据GhGL3的5'端UTR设计基因特异引物（GSP)。GhGL3启动子序列的扩 增经过三轮的扩增得到。其中第三轮包含两种方案，经拼接均可得到最终的4320bp的启动 子序列。经过NCBI数据库搜索得到GhGL3(AF336280)基因序列，包括544bp大小的5'端 UTR和1884bp的ORF序列，GSPl和GSP2位于此段的5'端UTR。根据第一轮扩增拼接得到 的序列设计GSP3,根据第二轮扩增拼接得到的序列设计GSP4和GSP5。所使用的基因特异 引物序列如下：
[0058] GSPl 5' CTATGAAGGTTGAAAGGAAGAGGAAA3'
[0059] GSP2 5' GAAAGGAGATACTGTTTATGAAGAT3'
[0060] GSP3 5' TCACTAGACTTATAAATTGAGGGTA3'
[0061] GSP4 5'AACGCATTTGAACTCATATCTTCCTAC3'
[0062] GSP5 5, AGAGTCCAACAATCATAGTCAACAAAG3，
[0063]
【主权项】
1. 一种GhGL3基因启动子，其特征在于，其具有如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的 核苷酸序列，或者是将如SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列经过一个或多个 核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列相同 的活性。
2. 如权利要求1所述的GhGL3基因启动子，其中所述GhGL3基因启动子的核苷酸序列 与所述SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列具有75%以上的同源性，或者与所述SEQ ID No. 2 所示的核苷酸序列具有80%以上的同源性。
3. 如权利要求1所述的GhGL3基因启动子，其中所述GhGL3基因启动子为在所述启动 子的任一片段上具有扩增的引物对的启动子，以及所述上游引物和下游引物之间的距离在 所述GhGL3基因启动子的第1碱基到第4320个碱基之间，优选在第2313碱基到第4320个 碱基之间，所述引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。
4. 含有如权利要求1至3任意一项所述的GhGL3基因启动子的载体。
5. 如权利要求4所述的载体，其中所述载体为pBIlOl. 2-GhGL3pro ::⑶S。
6. 如权利要求4所述的载体，其中在所述GhGL3基因启动子转录起始后加入了别的基 因的编码序列或增强子。
7. 如权利要求4所述的载体，其中在所述载体中加入了植物可选择性标记或具有抗性 的抗生素标记物。
8. 如权利要求4所述的载体，所述载体通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接 DNA转化、微注射或电导技术方法导入植物细胞。
9. 含有如权利要求4至8任意一项所述的载体的宿主细胞。
10. 含有如权利要求1至3任意一项所述的GhGL3基因启动子的转化植物细胞。
【专利摘要】本发明公开了一种基因GhGL3的启动子，是具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，或者是将如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列相同的活性。本发明涉及该启动子的载体、宿主细胞及该启动子或载体在植物新品种培育上的应用。本发明的启动子可以驱动目的基因在棉纤维和表皮毛中特异表达，并且对培育纤维植物新品种，特别是培育棉花新品种具有重要意义。
【IPC分类】C12N15-113, C12N5-10, C12N15-82
【公开号】CN104611338
【申请号】CN201510090562
【发明人】薛勇彪, 李群, 陆春霞, 普莉
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年2月28日