化了可凝结的TgFVII/TgFVIIa。
[0225] 2. 5 超滤
[0226] 作为替代，使用超滤技术来制造可存储的中间产物。将亲和S/D处理的洗脱液浓 缩，并稳定在30kDa的聚醚砜膜（来自Novasep的单次使用的TangenXSius-LS?:)上。 在浓缩阶段通过调节再循环泵速度将跨膜压力保持在20psig。当获得2g/L的蛋白质浓度 时，在柠檬酸盐缓冲液中进行渗滤，以除去亲水性化合物、其盐和化学溶剂。
[0227] 2. 6无菌过滤和冷冻-中间产品1
[0228] 将比活性为2638单位（按mg计）的io. 4L的浓缩中间体用Sartobran?1 0. 45/0. 2 y m囊在层流通风橱下无菌过滤到1L的容器中。
[0229] 将瓶<-60°C存储，以构成用于下游工艺的中间产物。
[0230] 2. 7 0? 2/0. 1 ii m过滤以及在20N和15N Planova过滤器上纳米过滤
[0231] 进一步纯化对于TgFVII/TgFVIIa产物的临床和药物人类使用是必要的。首先，为 了减少潜在的病毒负载，通过过滤序列（filtration train)过滤中间物：
[0232] ?来自 Sartorius 的 0? 2/0. 1 u m Sartopore 2?一次性囊
[0233] ? lsq. mPlanova?: 20 后跟来自 ASAHI KASEI 的 lsq. m Plauova? 15
[0234] 将9. 45L中间物以12LMH的初始流速直接泵送通过过滤序列并在整个步骤期间 监测跨膜压力以维持每个纳米过滤器最大12psig。在该工艺的这一步骤中，计算纯度约 95 %，并将内源性转铁蛋白确定为主要的污染物之一。
[0235] 在该工艺的这个阶段，通过在还原条件下的SDS-PAGE分析定量评估TgFVII活化 在20%至50%之间。部分活化是由于在纯化工艺的澄清阶段释放的乳钙。
[0236] 2. 8在Q琼脂糖XL上的离子交换色谱
[0237] TgFVII的纯度和活化通过阴离子交换色谱和钙依赖性洗脱增强。将纳米过滤 溶液装载到先前用pH 7.0的10mM柠檬酸钠平衡过的Q-琼脂糖XL阴离子交换器（GE Healthcare)上。
[0238] 用20mM的pH 7. 5且在25°C的电导率低于5mS/cm的咪唑执行第一洗涤步骤。第 二洗涤步骤通过除了 20mM咪唑外还引入150mM氯化钠以在25°C下达到18mS/cm的电导率 来执行。洗涤峰被鉴定为主要由游离的转铁蛋白组成。然后通过降低氯化钠盐至50mM，并 在同一时间通过加入氯化钙直至7mM，同时保持咪唑为20mM来洗脱TgFVII/TgFVIIa。洗脱 级分含有在还原条件下通过SDS-PAGE评估的90%以上的TgFVIIa的活化形式。通过ELISA 测量RMP水平并与TgFVII比较，计算残余的RMP低于500ppm(见表3)。
[0239] QSXL色谱有助于HRI水平的降低，平均得分为2 log1(l，其中1. 6 log1(l是转铁蛋 白。
[0240] 在该步骤中，通过在洗脱缓冲液中存在离子化钙而增强向FVIIa的活化。然后将 Q-S印harose XL洗脱液存储在+2/+8°C下过夜。
[0241] 2.9羟磷灰石上的伪亲和色谱
[0242] 在存储期间，可能发生某些FVII裂解，尤其是重链上的裂解，轻链由钙离子保护。 公知的是羟磷灰石和磷酸钙吸附剂吸附凝固因子如FVII/FVIIa和更广泛的含Gla结构域 的蛋白质。这个伪亲和性用于该工艺的抛光步骤。
[0243] 将含有转基因FVII/FVIIa的Q S印harose XL洗脱液在预先用pH8. 0的25mM磷 酸钾平衡过的CHT陶瓷羟磷灰石I型柱（BioRad)上浓缩。
[0244] 用pH8. 0的25mM的磷酸钾进行恒溶剂洗涤步骤。该洗涤步骤特异地洗脱蛋白水 解的形式，尤其是在其重链上含有一个或多个裂解的TgFVII/TgFVIIa并被监测以限制在 恒溶剂模式下所有活化形式的最小损失。
[0245] 随后用pH 8. 0的150mM磷酸钾将TgFVII/TgFVIIa洗脱为TgFVIIa浓缩物。
[0246] 2. 10 在 Superdex 200 上尺寸排阻色谱（SEC)
[0247] 单体TgFVII/TgFVIIa的稳定化是由该工艺的最后抛光步骤完成的。SEC允许除去 磷酸钾并配制到至少聚山梨醇酯80和精氨酸中。
[0248] 将从羟磷灰石色谱柱洗脱的和含有TgFVII/TgFVIIa的级分加载到预先用5mM柠 檬酸钠、114mM精氨酸HCl、46mM异亮氨酸、16mM甘氨酸、6. 5mM赖氨酸、0. 07% (v/v) Tween 80、pH 6.0平衡过的Superdex 200柱（GEHealthcare)上。
[0249] 具有较高的动态半径或较高分子大小的蛋白质如转铁蛋白（70kDa)或与其它蛋 白质复合的FVII刚好在单体TgFVIIa(45kDa)之前通过尺寸排阻洗脱。
[0250] 具有较低的动态半径或较低的分子大小的蛋白质像酪蛋白或肽紧跟在单体 TgFVIIa(45kDa)之后洗脱。
[0251] 用与平衡该柱所用相同的缓冲液洗脱含有TgFVII/TgFVIIa的级分。
[0252] 2. 11稳定化和配制
[0253] 最终的TgFVII/TgFVIIa溶液配制为在配制缓冲液中lg TgFVIIa/L的浓度，所述 配制缓冲液包含5mM柠檬酸钠、114mM精氨酸HC1、46mM异亮氨酸、16mM甘氨酸、6. 5mM赖氨 酸、0.07% (v/v)Tween 80，pH 6.0。
[0254] 通过SDS-PAGE在还原条件下评估93. 5%的活化形式的TgFVIIa。
[0255] 2. 12 灭菌
[0256] 然后将 5243mL 配制的稳定化的 TgFVII/TgFVIIa 溶液在 0. 2 ii m Millipak 100 膜 上无菌过滤。
[0257] 实施例3 :工艺中分析结果
[0258] 对在实施例2中所述在纯化工艺中产生的样品进行分析。
[0259] 3. 1纯化工艺重复性
[0260] 对8批次的每个步骤（后接FVII酰胺分解测定或吸光度）的FVII收率在表1和 2中总结。
[0261] 表1 :直至超滤的FVII酰胺分解收率
[0262]
【主权项】
1. 一种从源生物材料纯化转基因因子VII (TgFVII)和/或转基因活化因子 VII (TgFVIIa)的方法，包括亲和色谱的步骤，该亲和色谱包括步骤： (a) 在允许TgFVII和/或TgFVIIa结合配体的条件下，使含有TgFVII和/或TgFVIIa 的源生物材料接触对TgFVII和/或TgFVIIa特异的配体，和 (b) 通过以非破坏性的方式打断与所述配体的相互作用，回收TgFVII和/或TgFVIIa。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述配体是针对至少一种TgFVII或TgFVIIa表位的抗 原结合蛋白质，或其功能片段或衍生物。
3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述配体包括形成两个完整的抗原结合位点的两 条重多肽链且缺乏轻多肽链。
4. 根据权利要求1至3的方法，其中所述配体源自骆驼科的免疫球蛋白重链。
5. 根据权利要求1至4的方法，其中步骤（b)包括至少一个洗涤步骤，用于在从配体洗 脱TgFVII或TgFVIIa之前除去未结合的材料，并且进一步任选地包括用于除去弱结合的材 料的第二洗涤步骤。
6. 根据权利要求1至5的方法，其中所述源生物材料获自生产TgFVII和/或TgFVIIa 的转基因动物。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述动物是哺乳动物雌性，并优选雌兔，以及源生物材 料是乳。
8. 根据权利要求7的方法，还包括在步骤（a)之前的收集并澄清乳的预备步骤。
9. 根据权利要求8的方法，其中通过加入柠檬酸盐，然后过滤来执行乳澄清步骤。
10. 根据权利要求1至9的方法，还包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留在离子 交换剂上的条件下，在离子交换剂上，并优选在阴离子交换剂上，对洗脱的TgFVII和/或 TgFVIIa色谱纯化的步骤c)。
11. 根据权利要求1至10的方法，进一步包括在其中TgFVII和/或TgFVIIa被保留 在伪亲和树脂上的条件下，在伪亲和树脂，并优选在羟磷灰石上，对洗脱的TgFVII和/或 TgFVIIa色谱分离的步骤d)。
12. 根据权利要求1至11的方法，还包括在尺寸排阻支持物上对洗脱的TgFVII和/或 TgFVIIa色谱分离的步骤e)。
13. 根据权利要求1至12的方法，还包括消除和/或灭活病毒的至少一个步骤，优选通 过纳米过滤和/或通过溶剂/去污剂处理。
14. 根据权利要求1至13的方法，还包括配制、杀菌和冻干经纯化的TgFVII和/或 TgFVIIa的最终步骤。
15. 根据权利要求1至14的方法，其中亲和色谱的步骤包括步骤： (a)在使配体结合TgFVII和/或TgFVIIa的条件下，用来自含有重组产生的TgFVII和 /或TgFVIIa的转基因雌兔的乳装载固定有如权利要求1至4任一项所定义的配体的色谱 树脂； (bl)洗漆未结合的材料； (b2)洗涤弱结合的材料；和 (B3)从树脂洗脱TgFVII和/或TgFVIIa。
16. 根据权利要求5至15的方法，其中，在所述亲和色谱步骤期间，所述用于除去弱结 合的材料的第二洗涤步骤用含有10%至50%的疏水剂的缓冲液执行，并且其离子强度是 从200至600mM的范围。
17. 根据权利要求5至16的方法，其中，在所述的亲和色谱步骤期间，所述用于从树脂 洗脱了§?￥11和/或1 §?￥11&的洗脱步骤用含有20%至70%的疏水剂的缓冲液执行，并且 其离子强度是从500至2500mM的范围。
18. 根据权利要求1至17的方法，其中所得到的纯化的转基因FVII是几乎完全活化 的、高纯度的FVII，其包含低百分比的降解的、蛋白水解的或氧化的形式。
19. 根据权利要求1至18所述的方法，其特征在于，所述亲和色谱步骤和/或离子交 换色谱步骤和/或尺寸排阻色谱步骤允许获得优于31og 1(l，优选优于41og1(l，更优选优于 51〇g1(l的病毒降低系数。
【专利摘要】本发明涉及一种尤其是用于纯化转基因来源的重组人活化因子VII的抗因子VII亲和配体。组合其他正交色谱步骤的亲和配体允许制备高度纯化的FVII溶液，其完全活化、不含聚集体并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。
【IPC分类】G01N33-68, C12N9-64
【公开号】CN104640980
【申请号】CN201380048473
【发明人】D·巴塔勒, M·诺格雷
【申请人】法国血液分割暨生化制品实验室
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2013年7月18日
【公告号】CA2879109A1, EP2687595A1, EP2875129A1, US20150175983, WO2014013024A1