:5996-6007.)〇
[0007] 为了深入研宄NLK在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取肺癌、乳腺癌和前列腺 癌细胞模型，以RNAi为手段研宄NLK在肺癌、乳腺癌和前列腺癌发生和发展中的作用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于公开与人NLK(Nemo-like kinase)基因相关的治疗方法及药 物。
[0009] 本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研宄了 NLK基因在肿瘤发生和发展中的作 用，公开了 NLK基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0010] 较佳的，所述NLK基因来源于人。
[0011] NLK基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将NLK基因作为 药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将NLK基因 作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
[0012] 所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标具体是指：将NLK基因 作为药物或制剂针对肿瘤细胞产生RNA干扰作用的靶标，从而能降低肿瘤细胞中NLK基因 的表达水平。
[0013] 所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗 药物或制剂具体是指：将NLK基因作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制 或促进人NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如可NLK基因为作用对象筛选获得 的小分子干扰RNA，将之用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药 物等也可将NLK基因作为作用对象。
[0014] 所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与NLK基因的表达相关的任一种肿瘤，例如 选自：肺癌、乳腺癌和前列腺癌。
[0015] 所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制 NLK蛋白的表达或活性的分子。所述肿瘤治疗药物能降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平 从而抑制肿瘤细胞的增殖、生长、增殖、分化和/或存活。
[0016] 所述肿瘤治疗药物包括：核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或肽。
[0017] 所述核酸包括：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备 的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
[0018] 所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有NLK基因的启动子序列或NLK基因的 信息序列。
[0019] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含正义链和反 义链，所述正义链含有与NLK基因中的靶序列基本相同的核苷酸序列，且所述正义链和反 义链共同形成RNA二聚体。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段， 并特异性沉默人NLK基因的表达。
[0020] 所述shRNA可经载体表达，如将可转录该的shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体 后表达。
[0021] 所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低NLK基因的转录或翻译，或者足够降低 NLK蛋白的表达或活性的剂量。以使NLK基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或 99%〇
[0022] 本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的寡核苷酸分 子，所述寡核苷酸分子包含：
[0023] 1)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序 列；
[0024] 2)或者shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序 列；或者
[0025] 所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与NLK基因中15-27个连续的核 苷酸基本相同，而所述第二链与第一链基本互补。较佳的，所述第一链与NLK基因中19-23 个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述第一链与NLK基因中19、20或者21个连续的核苷 酸基本相同。
[0026] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA。
[0027] 所述shRNA包含正义RNA片段和反义RNA片段，所述正义RNA片段与NLK基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述反义RNA片段与正义RNA片段基本互补，且所述正 义RNA片段和反义RNA片段中间由茎环片段分隔。所述shRNA经酶切后可成为小干扰RNA 进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NLK基因的表达的作用。较佳的，所述正义RNA片段与 NLK基因中19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述正义RNA片段与NLK基因中19、 20或者21个连续的核苷酸基本相同。
[0028] 所述shRNA的茎环片段的序列可选自以下任一 ：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、 CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACCo
[0029] 所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义RNA片段与NLK基因中的靶序列基本 相同。
[0030] 所述NLK基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默NLK基因表达时， 与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的NLK基因中的片段。
[0031] 较佳的，所述NLK基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-39中之任一序列。
[0032] 较佳的，所述NLK基因来源于人。
[0033] 如本发明的实施例列举的，所述shRNA的序列含有SEQ ID NO:40。
[0034] GCAGCC⑶CAUUACAGCAAUUCAAGAGAUUGC腳AAUGACGGCUGC
[0035] 本发明第三方面，公开了一种NLK基因干扰慢病毒载体，为含有编码所述shRNA的 基因片段的慢病毒载体，能表达所述shRNA。
[0036] NLK基因干扰慢病毒载体可由将编码所述shRNA的DNA片段克隆入慢病毒载体后 获得。
[0037] 所述NLK基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿 瘤细胞，并进而转录出所述shRNA。
[0038] 所述NLK基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测 的标记物的核苷酸序列。所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP)。
[0039] 所述慢病毒载体可选自以下任一 ：pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-tGFP、pLKO. 1-CMV-Neo、pLKO. 1-Neo、pLKO. 1-Neo-CMV-tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagYFP、pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、 pLKO. l-pur〇-CMV-TagFP635、pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO. l-pur〇-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-pur〇-IPTG-3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAL 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 和 Lenti6. 2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
[0040] 所述分离的寡核苷酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿 瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。
[0041] 当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的双链RNA或ShRNA施用于哺 乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能 范围之内的。
[0042] 本发明第四方面，公开了一种NLK基因干扰慢病毒，为将能够在肿瘤细胞中经转 录成为所述shRNA的核苷酸片段克隆入慢病毒载体后，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助 下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生特异性沉默NLK基因的所述小分 子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
[0043] 所述NLK基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿 瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。
[0044] 本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合 物中含有所述的能够降低NLK基因表达的分离的寡核苷酸分子或NLK基因干扰慢病毒。
[0045] 所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂。
[0046] 在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可 以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体 材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖 浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀 粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯）、甜味剂等。
[0047] 所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，可将有效剂量的所述的药物组 合物施用于对象中。
[0048] 所述肿瘤可选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌