0] Anti-sense:5'ggtgatgcggcactcgatctccatg3'
[0041] 部分测序结果见图2。
[0042] 实施例3 :目的质粒和包装质粒的大量提取
[0043] 将p⑶H-CAR质粒、p⑶H-空载体质粒、以及psPAX2和pMD2.G包装质粒的菌株在 LB培养液中大量培养，以碱裂解法大量提取质粒（北京天根生化科技有限公司无内毒素质 粒提取试剂盒），以备转染。
[0044] 1)将菌液按1 :1000的比例加入150~200ml含Amp的LB培养液中，37°C恒温孵 箱 200rpm震摇 12_16h;
[0045] 2)取少量菌液测A_值，达0. 4左右后取出；
[0046] 3)向吸附柱CP5中加入2. 5ml的平衡液BL，10,OOOrpm离心2min，倒掉收集管中 的废液，将吸附柱重新放回收集管中备用。
[0047] 4)将菌液于4°C10,OOOrpm离心3min，收集细菌沉淀；
[0048] 5)加入7ml溶液I(确定已加入RNaseA)，彻底混悬细菌；
[0049] 6)加入7ml溶液2,立即轻柔颠倒混勾，室温放置5min;
[0050] 7)加入7ml溶液4,立即温和颠倒混勾，室温放置IOmin, 10,OOOrpm离心15~ 30min；
[0051] 8)将溶液全部倒入过滤器CS中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集于50ml离心管中， 加入0. 3倍体积的异丙醇，混匀后转移到吸附柱CP5中；
[0052] 9)室温10,OOOrpm离心2min，弃废液；将步骤8所得溶液分两次过柱，每次均按照 前述条件操作；
[0053] 10)向吸附柱中加入IOml漂洗液PW(确定已加入无水乙醇），10,OOOrpm离心 2min，弃废液；
[0054] 11)重复操作步骤10 ;
[0055] 12)向吸附柱中加入3ml无水乙醇，室温10,OOOrpm离心2min，弃废液；
[0056] 13)将吸附柱CP5放回收集管中，10,OOOrpm离心5min，目的是将吸附柱中残余的 漂洗液去除；
[0057] 14)无菌超净台内，将吸附柱转入新的50mlEP管，向吸附膜的中间位置悬空滴加 l_2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min后10,OOOrpm离心2min;
[0058] 15)将50mlEP管中的洗脱液全部分装移入干净的I. 5mlEP管中，-20°C冻存备用；
[0059] 16)取2yIDNA溶液紫外分光光度法测质粒DNA浓度和A26tlA28tl，并同时进行琼脂 糖凝胶电泳分析提取质粒的质量。
[0060] 实施例4 :慢病毒的包装、浓缩和滴度测定
[0061] 4.1慢病毒的包装：
[0062] 1.细胞处理：转染前24h用胰酶消化、收集处于对数生长期的第4-12代293T细 胞，将5XIO6 293T细胞接种于IOcm培养板中，细胞在含有IOml10%FBS的DMEM培养基 中生长，置37°C5%COJ?箱培养24h，达60-80%汇合率时可进行转染。
[0063] 2.转染体系配制
[0064] 1)于4ml灭菌EP管内加入2ml无血清DMEM培养基，再加入15yg质粒（p⑶H-CAR 目的质粒或P⑶H-空载体质粒：psPAX2 :pMD2.G= 7 :6 :2)，充分混匀，最后加入30y1转染 试剂PEI(浓度为Iyg/yI)[PEI(yg):总DNA(yg) = 2 :1]，充分混勾，室温静置15min;
[0065] 2)从原IOcm培养皿中小心吸除2ml培养液；
[0066] 3)将上述质粒-PEI混合液逐滴加入IOcm培养皿上，边滴边摇，小心混匀；
[0067] 4)将培养皿放入37°C5% 0)2孵箱培养12-16h;弃去培养基，更换为含10%FBS 的新鲜DMEM培养液5ml，继续培养；
[0068] 5)转染換液后24h，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分 别于转染換液后24h、48h收集293T培养上清于50ml离心管中，室温3000rpm离心15分钟， 收集上清；
[0069] 6)用0. 45ym滤器过滤病毒上清，分别获得p⑶H-空载体和p⑶H-CAR病毒原液；
[0070] 4. 2病毒浓缩：
[0071]将病毒原液4°C50,OOOg离心90min，弃上清，病毒沉淀用无血清RPMI1640培养 基200y1/dish的量重悬（即浓缩25倍），获得病毒浓缩液，-80°C冻存备用。
[0072] 4. 3病毒滴度测定：
[0073] 用病毒原液梯度感染293T细胞，感染后48h流式细胞仪检测GFP阳性率，根据公 式推算出P⑶H-空载体和p⑶H-CAR病毒原液的滴度约为IXIO7TUAil和IXIO6TUAil。
[0074] 实施例5:T细胞的体外培养、感染和扩增
[0075] 1.从天津中心血站取健康供者富含血小板白膜，用Ficoll分离液和人T细胞富集 抗体混合物（StemCell公司）分离获得较纯的⑶3+T细胞（占95%以上），用含10%FBS 的RPMI1640培养基调整细胞浓度至IX106/ml，将细胞以Iml/孔接种到预先用抗人⑶3 和⑶28抗体（eBioscience，用量为5yg/ml)包被的24孔板，再加入200IU/ml重组人白细 胞介素2 (rhIL-2)，刺激培养24h后病毒感染；
[0076] 2.向培养24h的T细胞中每孔分别加入p⑶H-空载体或p⑶H-CAR病毒浓缩液 200y1 或 400y1，以及终浓度为 4yg/ml的polybrene，混勾，32°C1800rpm离心 90min，置 于孵箱培养，24h内不换液；
[0077] 3.感染后24h进行第二次感染，将细胞1000 rpm离心lOmin，小心吸去上清，加入 新鲜含10%FBS的RPMI1640培养液重悬细胞后调整细胞浓度至IX106/ml，以Iml/孔 接种到预先用Retronectin包被的新的24孔板，再加入200IU/mlrhIL-2,病毒浓缩液和 polybrene用量同前，32°C1800rpm离心90min后置于孵箱继续培养；
[0078] 4.继续培养24h后将细胞以lOOOrpm，IOmin离心換液，以IXIO6Ail的密度接种 于孔板内，rhIL-2200IU/ml刺激培养，以后每2-3天換液一次，细胞生长密度和rhIL-2用 量同前，直至使用；
[0079] 5.感染后96h，用荧光显微镜观察T细胞的绿色荧光表达情况并照相。结果见图 3〇
[0080] 6.收集细胞后，1000 rpm离心10min，PBS洗涤1次，用适量PBS重悬细胞置于流式 管中，用流式细胞仪检测GFP阳性率。结果见图4。
[0081] 实施例6 :流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白的表达
[0082] 分别离心收集感染后96h的待检测细胞及对照组细胞，PBS洗涤1次后弃上清，按 抗体说明书加入相应检测量的单抗避光30min后PBS洗涤、重悬，过膜后流式细胞仪检测。 CD3(+)由APCanti-humanCD3 标记，CAR(+)由Biotinanti-mouseIgG，F(ab'）2和APC/ Cy7Streptavidin标记。结果见图5〇
[0083] 实施例7 :体外共培养测定CAR-T细胞的肿瘤杀伤作用
[0084] 7. 1流式细胞术监测肿瘤细胞的比例变化：
[0085] 取感染后一周的T细胞和⑶19抗原表达阳性的淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6细 胞，均制成IXIO6Ail细胞悬液，按3种效靶比（E:T)共培养于24孔板。分别为A组：T细 胞2XIO5细胞/孔，Nalm-6细胞IX10 5细胞/孔。B组：T细胞2X10 5细胞/孔，Nalm-6 细胞2XIO5细胞/孔。C组：T细胞2X10 5细胞/孔，Nalm-6细胞4X10 5细胞/孔。每组 均设实验组和对照组，实验组为CAR-T细胞，对照组为空载体感染的T细胞（标记为VEC-T 细胞）。同时设置单细胞组仅供检测细胞因子用，即D组：CAR-T细胞2XIO5细胞/孔；E 组：VEC-T细胞2XIO5细胞/孔。每组均设7个复孔，各孔均用含10%FBS的RPMI1640培 养基补足总体积为lml，分别于孵箱培养0h、12h、24h、36h、48h、60h和72h后流式细胞仪检 测体系中Nalm-6细胞的比例。具体操作为：将细胞收集到I. 5ml灭菌EP管，室温2000rpm 离心3min，谨慎吸取上清分装于新的I. 5ml灭菌EP管，-20°C冻存以备ELISA检测细胞因 子用。细胞沉淀用PBS洗1次，再按抗体说明书加入相应检测量的PE/Cy7anti-human⑶19 单抗，冰上避光孵育30min后PBS洗涤、重悬，过膜后流式细胞仪检测Nalm- 6细胞的比例 变化。结果见图6。
[0086] 7. 2ELISA法测定细胞因子