的水平：
[0087] ELISA试剂盒（购自R&D公司），按试剂盒说明操作。
[0088] 1)待检测样品来自于C组、D组和E组培养36h的上清，从_20°C取出，室温融化。
[0089] 2)将浓缩洗涤液、浓缩稀释液、标准品、密封板条从冰箱中取出室温预温。
[0090] 3)分别将浓缩洗涤液（25X)和浓缩稀释液（5X)用双蒸水稀释至工作浓度（IX)。
[0091] 4)制备标准品：加入稀释液至冻干标准品中，轻轻震荡至少15min至彻底溶解，混 匀，稀释至 2000、1000、500、250、125、62. 5、31. 25、15. 6 和Opg/ml。
[0092] 5)制备样品：将步骤1)所述待检样品用稀释液做5倍稀释。
[0093] 6)分别将稀释后的样品或不同浓度的标准品加入相应孔中100y1/孔，用封板胶 纸封住反应孔，室温孵育2h。
[0094] 7)洗板 4 次，200y1/ 孔。
[0095] 8)将检测抗体平衡至室温，加入200y1/孔，用封板胶纸封住反应孔，室温孵育 2h〇
[0096] 9)洗板 4 次，200y1/ 孔。。
[0097] 10)将显色底物A液和B液平衡至室温，避光，等体积混合后15min内加到各孔 200y1/孔，室温避光孵育30min(视显色深浅灵活掌握）。
[0098] 11)将终止液平衡至室温，加入终止液50y1/孔，混匀后30min内酶标仪 450nm(检测波长）和570nm(校正波长）波长测量吸收值（OD45tl和OD57上
[0099] 12)绘出4参数（4-PL)线性标准曲线，通过样品的OD值查出其浓度。结果见图 7。7. 3Cyt〇T〇X 96?非放射性细胞毒性法检测CAR-T细胞对Nalm-6细胞的杀伤活性：
[0100] 试剂盒购自Promega公司，按说明书操作。
[0101] 1.优化靶细胞数目：
[0102] 1)靶细胞制备：800rpm离心5min收集对数生长期Nalm-6细胞，用含5%FBS的 RPMI1640调整靶细胞浓度至IXl〇7ml。
[0103] 2)LDH阳性对照配制：轻轻振荡LDH阳性对照以混匀，然后取2y1稀释到IOml的 PBS+1 %BSA(1:5, 000 稀释）。
[0104] 3)在U底96孔板设置检验孔（三复孔）：
[0105] a?培养基背景对照：110y1/孔含5%FBS的RPMI1640。
[0106] b.LDH阳性对照：110y1/孔步骤2)中稀释的LDH。
[0107] c.靶细胞最大释放：设置靶细胞数目为0、5X103、1X104、2X104、3X10^ 4X104,用含5%FBS的RPMI1640补足每孔的体积为100y1，并在各孔加入10y1细胞裂 解液（IOX)。
[0108] 4)置37°C，5%CO2，饱和湿度孵箱孵育45分钟，200g离心平板4min。
[0109] 5)乳酸脱氢酶活性测定
[0110]a.转移50y1步骤4)培养上清至另一 96孔新酶标板；
[0111] b?解冻AssayBuffer，取 12mlBuffer溶解LDH底物；
[0112] c.加50yILDH底物至96孔酶标板，室温避光反应30min;
[0113] d.每孔加50y1终止液终止酶促反应；
[0114] e.酶标仪490nm测定吸光度（A490)。
[0115] 6)确定靶细胞的吸光值至少是培养基背景对照吸光值的两倍时的靶细胞数目为 4X10'
[0116] 2.细胞毒性检测：
[0117] 1)靶细胞制备：800rpm离心5min收集对数生长期Nalm-6细胞，用含5%FBS的 RPMI1640调整细胞浓度至4Xl〇7ml。
[0118] 2)效应细胞制备：1000rpm离心IOmin收集感染后一周的CAR-T和VEC-T细胞，用 含5%FBS的RPMI1640调整细胞浓度至2X106/ml。
[0119] 3)在U底96孔板设置下列对照组和实验组（三复孔）：
[0120] a?培养基背景对照：110y1 含 5%FBS的RPMI1640。
[0121] b.体积校正对照：100y1含5%FBS的RPMI1640+10y1细胞裂解液（IOX)。
[0122] c?靶细胞自发释放：10yINalm-6(4X104cells)+100y1 含 5 %FBS的RPMI 1640。
[0123] d?靶细胞最大释放：10yINalm-6+90y1 含 5%FBS的RPMI1640+10y1 细胞裂 解液（IOX)。
[0124] e.效应细胞自发释放：按不同效：靶比例（1:4, 2:4和4:4)加效应细胞5yl、 IOyl、20y1/孔，均用含5%FBS的RPMI1640补足体积为IlOy1/孔。
[0125] f.实验组：按上述效：靶比例加入效应细胞和靶细胞，用含5%FBS的RPMI1640 补足体积为110y1/孔。
[0126] 4)200g离心96孔平板4min。置37°C，5%CO2，饱和湿度孵箱孵育7h。提前45分 钟在靶细胞最大释放孔加10U1细胞裂解液（IOX)。200g离心平板4min。
[0127] 5)乳酸脱氢酶活性测定：步骤同前述。
[0128] 6)CTL活性计算
[0129] 计算各组（3复孔）平均吸光度（A49tl)，按下列公式计算CTL裂解靶细胞的百分率。
[0130]
【主权项】
1. 一种嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于，所述嵌合抗原受体 由抗人⑶19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区h⑶19scFv、人⑶8a铰链区、人⑶28跨 膜区和胞内区、以及人CD3G胞内区结构串联构成；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如序 列表中SEQIDNO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于， 所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQIDNO. 2所示。
3. 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于， 所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其氨基酸序列如SEQID NO. 3所示，该单链抗体的轻链和重链之间有个GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySer GlyGlyGlyGlySer连接肽。
4. 根据权利要求3所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在 于，所述嵌合抗原受体含有针对人CD19抗原的单链抗体hCD19scFv，其核酸序列如SEQID NO. 4所示。
5. 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于， 所述嵌合抗原受体以人CDSa铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3G胞内区串联 而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQIDNO. 5所示。
6. 根据权利要求5所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于， 所述嵌合抗原受体以人CDSa铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3G胞内区串联 而成的结构为信号传导结构域，其核酸序列如SEQIDNO. 6所示。
7. 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于， 所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8a信号肽，其氨基酸序列如序列表中的SEQID NO. 7所示。
8. 根据权利要求7所述的嵌合抗原受体h⑶19scFv-⑶8a-⑶28-⑶3e，其特征在于， 所述嵌合抗原受体的氨基末端含有一个CD8a信号肽，其核酸序列如SEQIDNO. 8所示。
9. 如权利要求1所述的嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8a-CD28-CD3G在制备嵌合抗原 受体T细胞及其在肿瘤治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ及其用途，该嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内区结构串联构成。该嵌合抗原受体用于修饰T淋巴细胞，修饰后的T细胞(CAR-T细胞)能用于表面CD19阳性的肿瘤的治疗。
【IPC分类】C07K19-00, A61K35-17, C12N15-62, A61P35-00
【公开号】CN104788573
【申请号】CN201510233748
【发明人】王建祥, 王敏, 安娜, 饶青, 廖小龙, 邢海燕
【申请人】中国医学科学院血液病医院（血液学研究所）
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年5月8日