g(0. 076mmol)的最终产物。
[0345] 实施例10:
[0346] (S) -1-((2S，4R) -1- (4-(苄基氧基）-3，5-二甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0347]
[0348]起始于市售Sieber酰胺树脂（165mg，0. lOmmol，1当量），市售Fmoc保护的L脯氨 酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)和中间体 13((2S，4R)-1-(4-(苄基氧基）-3,5_ 二 甲氧基苯甲酰基）-4-乙酰氧基吡咯烷-2-羧酸）（90mg，0. 20mmol)，根据上述步骤E来制备 产物。通过RP-HPLC纯化获得6. 2mg(0. 012mmol)的最终产物。
[0349] 实施例11 :
[0350] (S) -1-((2S) -1- (4-乙酰氧基-3, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0351]
[0352] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 40mmol)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 40mmol)和中间体 14(4-乙醜 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（96mg，0. 40mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0? lOmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得25mg(0. 054mmol)的最终产物。
[0353] 实施例12 :
[0354] (S)-1-((2S)-1_(4-苯甲酰氧基_3,5_二甲氧基苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0355]
[0356] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo 1)和中间体 15 (4-苯甲醜 氧基-3,5-二甲氧基苯甲酸）（12111^，0.4111皿)1)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得26mg(0. 051mmol)的最终产物。
[0357] 实施例13 :
[0358] (S) -1- ((2S) -1- (3,4-二苄基氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0359]
[0360] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo1)和中间体 16 (3,4-二节 基氧基-5-甲氧基苯甲酸）（146mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0. lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得24mg(0. 041mmol)的最终产物。
[0361] 实施例14:
[0362] (S) -1- ((2S) -1- (3,4-二苯甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0363]
[0364] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 4mmo 1)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（149mg，0? 4mmo1)和中间体 17 (3,4-二苯 甲酰氧基-5-甲氧基苯甲酸）（157mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0. lmmol，1当量）。通过RP-HPLC纯化获得31mg(0. 052mmol)的最终产物。
[0365] 实施例15 :
[0366] (S) -1-((2S) -1- (3-乙酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰 基）吡咯烷-2-甲腈
[0367]
[0368] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0? 4mmol)、Fmoc-4,4-二氟-L-腫氨酸（149mg，0? 4mmol)和中间体 18 (3-乙酰氧 基-4,5-二甲氧基苯甲酸）（96mg，0. 4mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（165mg， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得22mg(0. 048mmol)的最终产物。
[0369] 实施例16:
[0370] (S) -1-((2S) -1- (3-特戊酰氧基-4, 5-二甲氧基苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯 烧_2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0371]
[0372] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (135mg，0. 4mmol)、Fmoc-4,4_ 二氟-L-脯氨酸（149mg，0. 4mmol)和中间体 19(3-特戊酰 氧基-4,5-二甲氧基苯甲酸）（11311^，0.4_31)依次偶联到市售516匕61'酰胺树脂（16511^， 0? lmmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得19mg(0. 040mmol)的最终产物。
[0373] 实施例17 :
[0374] (S)-1-((S)-1-(4_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0375]
[0376] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和4-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上。通过 RP-HPLC纯化获得17mg(0. 038mmol)的最终产物。
[0377] 实施例18 :
[0378] (S)-1-((S)-1-(3_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0379]
[0380] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和3-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上。通过 RP-HPLC纯化获得8mg(0. 018mmol)的最终产物。
[0381] 实施例19 :
[0382] (S)-1-((S)-1-(2_(苄基氧基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯烷-2-羰基）吡咯 烷-2-甲腈
[0383]
[0384] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (15〇11^，0.45_〇1)、卩1]1〇(3-4,4-二氣-1^-腫氛酸（16611^，0.45_〇1)和2-苄基氧基苯甲酸 (101mg，0.45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol，l当量）上，通过 RP-HPLC纯化获得5mg(0.0 llmmol)的最终产物。
[0385] 实施例20 :
[0386] (S)-1-((S)-1-(4_(苄基氧基）-3_(三氟甲基）苯甲酰基）_4,4_二氟吡咯 烧 _2_幾基）R比略烧-2-甲腈
[0387]
[0388] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (150mg, 0. 45mmol)、Fmoc-4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（l66mg，0? 45mmol)和中间体 2〇 (4-苄基 氧基-3-三氟甲基苯甲酸）（132mg，0. 45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg， 0? 15mmol，1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得32mg(0. 061mmol)的最终产物。
[0389] 实施例21 :
[0390] (S) -1- ((S) -1- (4-(苄基氧基）-3-氟苯甲酰基）-4,4-二氟吡咯烷-2-羰基）吡 咯烷-2-甲腈
[0391]
[0392] 通过以上步骤E所述的分步偶联将市售Fmoc保护的L脯氨酸（Fmoc-L-Pro-OH) (150mg, 0. 45mmol)、Fmoc_4,4-二氣 _L_ 腫氛酸（l66mg，0? 45mmol)和中间体 21 (4-苄基氧 基-3-氟苯甲酸）（109mg，0. 45mmol)依次偶联到市售Sieber酰胺树脂（200mg，0. 15mmol， 1当量）上。通过RP-HPLC纯化获得14mg(0. 030mmol)的最终产物。
[0393] 药理学数据
[0394] 新化合物对（人）脯氨酰寡肽酶活性的抑制作用的测定
[0395] 脯氨酰寡肽酶（POP)的表达和纯化
[0396] 根据文献方法（Tarrag6 T等，ChemBioChem 2006 ;7 :827_33)通过在大肠杆菌 (E.coli)中表达并使用His尾融合的亲和纯化来获得P0P，概述如下：
[0397] hPOP表达：用pETMlO hPOP转化E. coli BL21感受态细胞。为了诱导表达，进行 将单菌落接种到含卡那霉素（50yg/mL)的LB培养基（50mL)并37°C下生长过夜的预培 养。次日，用过夜培养物（10mL)接种LB培养基的两个培养物（500mL)。使经接种培养物 在37°C和220rpm下生长直至0D 595为1.2(2. 5至3小时）。然后添加IPTG(最终浓度为 ImM)并且在25°C下进行诱导过夜。收集细胞（3500g，15分钟，4°C )并且使沉淀悬于悬浮 缓冲液（50mL) [Tris-HCl pH 8(50mM)、NaCl (300mM)、咪唑（ImM)]中并在 50%强度和 0? 5 脉冲下进行超声处理，采用四个循环（每一循环由15秒的超声处理和15秒的静止组成）， 将样品放置在冰上。超声处理后，对样品进行离心（40 000g，30分钟，4°C)并立即使用上 清液进行POP纯化。使用又KTAexplorer FPLC系统来进行纯化。在lmL/分钟的流速 下，将上清液施加至先前经5个柱体积的悬浮缓冲液平衡的HiTrapQuelating柱（5mL)中。 用悬浮缓冲液冲洗柱直至280nm处的吸光度回至基线水平。然后用5个体积的洗涤缓冲液 (50mM Tris-HCl，pH 8,300mM NaCl，30mM咪唑）来漂洗柱。用4个体积的洗脱缓冲液（50mM Tris-HCl，pH 8,300mM NaCl，500mM咪唑）进行洗脱。在整个洗脱期间收集各级分（4mL)。在 所有级分中检测POP活性并且通过SDS-PAGE来分析呈阳性的级分并用Biosafe Comassie Stain G-250染色。收集阳性级分并且通过使用具有作为缓冲液的Tris-HCl(50mM，pH 8) 的HiPr印26/10脱盐柱对其进行脱盐。采用具有BSA作为标准的Bio-Rad蛋白质测定来 定量重组的hPOP。制备重组酶的等分试样并立即用液氮冷冻并储存于-80°C。
[0398] POP抑制测定
[0399]根据 Toide 等所述的方法（Toide K 等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995 ;274 : 1370-8)将Z-G-P-AMC(N-苄基氧基羰基-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-酰胺）用作POP底 物来测定POP活性。反应在96孔微量滴定板中进行，这使得能够同时监测多个反应。对各 个反应而言，在37°C下将hPOP (根据hPOP批次的活性，范围为20nM至60nM)和相应新化 合物溶液（3 y 1)与活性缓冲液（134 y 1，100mM Na/K磷酸盐缓冲液，pH 8. 0)预孵育15分 钟。在DMSO(lOOmM)中制备新化合物的储液，并且使用DMS0由该储液制备稀释物。或者， 使用另一种活性缓冲液（141 y L，lOOmM Tris-乙酸盐，10mM BSA，ImM DIT，pH 7. 3)进行反 应，其与hPOP (lOnM)和相应新化合物溶液（3 y 1)(条件B)预孵育。
[0400]在预孵育后，添加 Z-G-P-AMC(40% 1，4_ 二p恶烷中 10yl，3mM) (40% 的 1，4_ 二p恶 烷中3yl，1.5mM，条件B)，并且在37°C下将反应孵育1小时。通过添加醋酸钠（150yl， lM，pH 4)终止反应并且使用焚光计量法（fluorimetrically)测定AMC的形成。激发和发 射波长分别为360/40nm和485/20nm。
[0401] 对每一化合物测定几个浓度点（范围为25pM至400 y M)。根据公式1计算对脯氨 酰寡肽酶的抑制活性。对各个新化合物而言，在存在hPOP (a)和不存在hPOP (b)时测定荧 光。在不存在抑制化合物时由hPOP样品获得最大荧光（0%抑制活性）。为了评价新化合 物的抑制效力，针对化合物的log浓度绘制活性，使用GraphPad Prism软件调节为S形曲 线，并且由所得曲线确定IC5Q值（定义为抑制50%的POP活性所需化合物浓度）。
[0402]
[0403]其中：
[0404] a对应于存在底物+测试的化合物+hP0P时的荧光强度
[0405] b对应于存在底物+测试的化合物时的荧光强度
[0406] c对应于存在底物+hP0P时的荧光强度
[0407] d对应于存在底物时的荧光强度。
[0408] 新化合物表现出针对人脯氨酰寡肽酶的高抑制效力。结果总结于表1中。
[0409] 表1:人脯氨酰寡肽酶的抑制
[0410]
[0411] ( * )条忏B卜所测疋的
[0412] 对相关脯氨酸特异性蛋白酶的抑制活性
[0413] 测试到新化合物对二肽基肽酶IV (DPPIV)活性的抑制作用。按照用于测定对脯氨 酰寡肽酶之抑制活性的上述方法，将G-P-AMC (H-Gly-Pro-甲基香豆素基-7-酰胺）用作底 物。在用活性缓冲液和相应化合物溶液对DPPIV进行预孵育后，添加G-P-AMC (40 % 1，4-二 v恶烷中10 y 1，750 yM)，并且在37°C下将反应孵育20分钟。通过添加醋酸钠（150 y 1，1M， pH 4)终止反应并且使用荧光测定法测定AMC的形成。对每一化合物测量几个浓度点（范 围为100 y M至400 y M)。根据公式1计算对DPPIV的抑制活性。没有一个新化合物示出针 对二肽基肽酶IV(400 yM的IC5(I值）的抑制活性，因此为特异性POP抑制剂。
[0414] 此外，测试新化合物针对成纤维细胞激活蛋白（FAP)的抑制活性。采用的方法与 用于测定对POP之抑制活性的上述方法类似。将Z-G-P-AMC用作底物，最终浓度为100 y M。 测定中使用的缓冲液为50mM Tris、lM NaCl、lmg/ml BSA pH:7. 5。在活性缓冲液中，使用 母液浓度为2 y g/mL的重组人FAP，这导致测定中的最终浓度为0. 1 y g/mL。在DMS0中制 备20mM的各新化合物的储液并且便于稀释。在37°C下将活性缓冲液和相应新化合物溶液 与FAP预孵育15分钟后，添加底物（活性缓冲液中50 y 1，100 y M)，并且在37°C下将反应 孵育1小时。通过添加醋酸钠（150 yl，lM，pH 4)终止反应并且使用荧光测定法测定AMC 的形成。对每一化合物测量几个浓度点（范围为100 至400 yM)。根据公式1计算对 FAP的抑制活性。没有一个新型化合物示出针对FAP的抑制活性（IC5(I值超过400 y M)，因 此为特异性POP抑制剂。
[0415] 化合物渗透特性的测定
[0416] 平行人工膜渗透性测定（PAMPA)
[0417] Kansy M等，J. Med. Chem. 1998 ;41 (7) : 1007-10中所述的平行人工膜渗透性测定 (PAMPA)用于测定化合物通过被动扩散跨越血脑屏障（BBB)的能力（Di L等，Eur. J.Med. Chem. 2003 ;38 (3) :223-32)。在200 y M的初始浓度下测定化合物的有效渗透性（Pe)。根据 制造商的说明书由商业浓缩的缓冲液来制备缓冲液。使用0. 5M NaOH溶液将pH调节至7. 4。 在DMS0中制备新化合物的储液并且用缓冲液稀释至200 yM的最终浓度（0. 5%的DMS0含 量）。将PAMPA夹层分离并且用200 y L的化合物溶液填充各个供体孔。将受体板放置到供体 板中，确保膜的底面与缓冲液相接触。将4yL的十二烷中的磷脂混合物（20mg/mL)添加至 各孔的过滤器中，并且将200 y L的缓冲液添加至各个受体孔中。覆盖平板并且在室温、饱 和湿度气氛和l〇〇rpm的轨道（orbital)搅拌下孵育4小时。4小时后，通过HPLC来分析受 体区室和供体区室的内容物：将来自供体板的每个孔的150yL和来自受体板的每个孔的 150yL转移至HPLC小瓶中，将各个样品注射入反相C 18柱（150mmX4.6mmX5ym，1〇〇 A )(100 y L/来自受体孔的注射物、10 y L/来自供体孔的注射物并且对h进行参照）。转运 还可通过MALDI-T0F光谱测定法加以证实。
[0418] 所用磷脂混合物为由Avanti polar lipids提供的猪脑极性脂质提取物，其具 有如下组成：12.6%卵磷脂（PC)、33. 1%磷脂酰乙醇胺（PE)、18.5%磷脂酰丝氨酸（PS)、 4. 1 %磷脂酰肌醇（PI)、0. 8 %磷脂酸和30. 9%