[0049] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 10068
【附图说明】
[0050] 图1为重组表达载体pET-28b(+)-flop的酶切产物的琼脂糖凝胶电泳。其中，泳 道1为NdeI和XhoI双酶切产物；泳道2为NdeI单酶切产物；泳道3为XhoI单酶切产物； 泳道 M 为 DNA Marker。
[0051 ] 图2为不同IPTG诱导时间的重组大肠杆菌BL21-pET28b-f Iop产生蛋白质 flop的含量比较的10 % SDS-PAGE的电泳图。其中，泳道1-10分别为重组大肠杆菌 BL21-pET28b-fIop 经过 8、9、10、11、12、13、14、15、16 和 17h 诱导后的蛋白质 fIop 的表达 量，泳道N为未诱导对照，泳道M为蛋白质Marker。
[0052] 图3为含有不同浓度咪唑的洗脱液洗脱的效果比较。其中，泳道1-8分别代表咪 唑的浓度依次为0、25、50、100、200、300、400和500mM，泳道M为蛋白质Marker。
[0053] 图4为不同菌株产蛋白质flop验证的10% SDS-PAGE电泳图。其中，图4中A为 未诱导菌体的菌液的10% SDS-PAGE电泳图；图4中B为各菌株的上清液的10% SDS-PAGE 电泳图；图4中C为各菌株的纯化后的蛋白质溶液的10% SDS-PAGE电泳图；图4中A 和图 4 中 B 中 1-10 号泳道分别代表 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌 株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株和 BL21-pET28b-flop-8 菌 株、BL21-CK菌株和BL21菌株，M代表蛋白质分子量Marker ;图4中C中1-10泳道分 别代表 BL21-CK 菌株、BL21 菌株、BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌 株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、 BL21-pET28b-f lop-6 菌株、BL21-pET28b-f lop-7 菌株和 BL21-pET28b-f lop-8 菌株，M 代表 蛋白质分子量Marker。
[0054] 图5为不同菌株产蛋白质flop验证的Western blot图。其中，图5中A为未诱导 菌体的菌液的Western blot图；图5中B为各菌株的上清液的Western blot图；图5中C为 各菌株的纯化后的蛋白质溶液的Western blot图；图5中A、图5中B和图5中C中1-10号 泳道分别代表 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、 BL21-pET28b-f lop-7 菌株和 BL21-pET28b-f lop-8 菌株、BL21-CK 菌株和 BL21 菌株，M 代表 蛋白质分子量Marker。
[0055] 图6为磺胺二甲基嘧啶浓度测定的标准品曲线。
【具体实施方式】
[0056] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0057] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0058] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0059] 下述实施例中的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae) R6 为 ATCC (American type culture collection)产品，编号为 ATCC'49619?(http://www. atcc.org/ATCCAdvan cedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default. aspx)〇
[0060] 大肠杆菌BL21(DE3)为德国Merk(Novagen)公司的产品，产品目录号为69387 ;表 达载体pET-28b (+)为德国Merk (Novagen)公司的产品，产品目录号为69865 ;蛋白纯化用 His · Bind? Columns为德国Merck的公司的产品，产品目录号为70971-3 ;T4 DNA Ligase 为美国Promega公司的产品，产品目录号为M1801S ;磺胺二甲基啼啶为美国Sigma-Aldrich 公司的产品，产品目录号为S6256 ;辣根过氧化物酶（HRP)为美国Sigma公司的产品；BCA蛋 白定量试剂盒为美国Pierce公司的产品。
[0061] 4_(4_ 氨基-苯横酰胺基）苯甲酸（N1-(4-Carboxyphenyl) sulfanilamide，CS)按 照下述文献中的方法制备：Development of a Single ELISA for Detection of Sulfonam ides. Hasmukh B. Sheth and Peter Sporns.J.Agric. Food Chem. 1991，39:1696-1700。
[0062] 下述实施例中的磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、 磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺甲噁 唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲 基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、氨苯磺胺、磺胺 多辛和酞磺胺噻唑均为Sigma-Aldrich公司的产品，产品目录号分别为：S6377、S0883、 S0758、 S6252、 S5632、 S7385、46902、46762、 N13251、 S7257、46908、 S5632、 S9882、02743、 S0383、S6256、32996、S7507、S8876、S8751、S7257、S5272、S8626、S9251、31736 和 46901。磺 胺醋酰、磺胺甲噻唑和磺胺溴二甲嘧啶均为中国药品生物制品鉴定所的产品，产品目录号 分别为：100413、100096、100412。
[0063] 下述实施例中的培养基及试剂配置如下：
[0064] LB液体培养基：pH为7. 2,由溶剂和溶质组成，溶剂为水；溶质及其浓度为：0. 5% (质量百分含量）酵母提取物，1% (质量百分含量）蛋白胨和1% (质量百分含量）NaCl。
[0065] Binding buffer :20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 IOmmol 咪唑，用水溶解，用 HCL 调 pH值至8. 0,并加水定容至1L。
[0066] Wash buffer :20mmol Tris、0. 5mol NaCl和任一种浓度的咪唑（1L溶液中的咪挫 终浓度分别为：20、25、50、100、200、300mM、400mM和500mM)用水溶解，用HCL调pH值至8. 0， 并加水定容至1L。
[0067] Elution buffer :20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 IOOmmol 咪唑用水溶解，用 HCL 调 pH值至8. 0,并加水定容至1L。
[0068] 80% (体积百分比）甘油的配制：取8mL甘油与2mL去离子水混合均勾，分装于冻 存管中，每管0. lmL，121°C灭菌20min。
[0069] 实施例1、构建产用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的重组大肠杆菌
[0070] 以肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae) R6基因组DNA作为模板，设计如下引 物R6-F(5'-GGAATTCCATATGTCAAGTAAAGCCAAT-3')(下划线的核苷酸序列为NdeI 酶切位点） 和 R6-R(5' -CCGCTCGAGTTATTTATATTGTTTTAAATC-3')(下划线的核苷酸序列为 XhoI 酶切位 点）进行PCR扩增，得到肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae) R6基因组的PCR产物。 米用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae) R6基因组 的PCR产物，得到945bp的目的基因片段，命名为flop基因，flop基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，编码SEQ ID NO. 1所示的用于检测多种磺胺药物的蛋白质蛋白质flop(简称 蛋白质flop)。
[0071] 将表达载体pET-28b (+)的NdeI和XhoI识别位点间的序列替换为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，保持表达载体pET-28b(+)的其它序列不变得到重组表达载体 pET-28b(+)-flop。经酶切鉴定（图1)和DNA测序证明，重组表达载体pET-28b(+)-flop 中的flop基因为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，编码SEQ ID NO. 1所示的蛋白质flop。
[0072] 将构建好的重组表达载体pET_28b (+) -f lop转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞 中，得到含有SEQ ID No. 2所示的用于编码蛋白质flop的DNA序列的重组菌株，将该菌株 命名为重组大肠杆菌BL21-pET28b-flop (下文中简称BL21-pET28b-flop菌株）；将表达载 体pET-28b(+)导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到不含有插入片段重组菌株，将 该菌株命名为重组大肠杆菌BL21-CK (下文中简称BL21-CK菌株），该菌株是空载体对照菌 株。
[0073] 实施例2、高产用于检测多种磺胺药物的蛋白质flop的重组大肠杆菌的筛选
[0074] -、蛋白质flop的制备与纯化条件的优化
[0075] 将重组大肠杆菌BL21-pET28b_flop接种于2mL含卡那霉素（浓度为30 μ g/mL) 的LB液体培养基中，在37°C，转速为250rpm条件下振摇培养12h，得到BL21-pET28b-flop 菌株的种子液。将ImL的BL21-pET28b-flop菌株的种子液接种于IOOmL含卡那霉素（浓 度为30