溶液H按照I :2 (v/v)的比例混合混合，室温搅拌4h，装入透析袋， 采用浓度为〇. 05M，pH值为7. 0的PBS缓冲液作为透析液进行透析72h，得到CS与HRP的 偶联物，即为酶标物。
[0112] 酶标工作液：采用样品稀释液将酶标物配置成浓度为1 μ g/mL的溶液，即为酶标 工作液。
[0113] -、蛋白质flop的灵敏度试验
[0114] 1、包被：将实施例2中获得的BL21-pET28b-flop-7菌株纯化后的蛋白质溶液采用 包被缓冲液稀释成浓度为1 μ g/mL的蛋白质flop溶液，加入到酶标板中，每孔100 μ L。
[0115] 2、洗涤与封闭：倾去孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min ;每孔加入150 μ L封 闭液，37°C恒温封闭lh，倾去孔内液体，然后用洗涤液洗涤3次，每次3min，得到酶标板。
[0116] 3、加样：
[0117] 3.1、标准品孔
[0118] 将磺胺药物标准品磺胺二甲基嘧啶用样品稀释液溶解，配置成如下浓度梯度的溶 液：50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL 和 I. 6ng/mL。向包被有蛋白质 flop的酶标板微孔中加入50 μ L上述一种浓度的磺胺二甲基嘧啶溶液，再加入酶标物工作 液50 μ L，用盖板膜封板。
[0119] 3. 2阴性对照孔
[0120] 与3. 1的区别仅在于将磺胺二甲基嘧啶溶液替换为等体积的高纯水，其它步骤不 变。
[0121] 3. 3空白对照孔
[0122] 与3. 1的区别仅在于将空白孔为将添加的蛋白质flop溶液替换为高纯水，其它步 骤不变。
[0123] 37°C恒温箱中反应30min，甩干孔中液体，每孔加入350 μ L洗涤液，30s后倒出孔 中液体，如此重复操作共洗板4次，用吸水纸拍干。
[0124] 4、显色：每孔加入IOOyL底物显色液，轻轻振荡混匀，37°C恒温箱避光显色 lOmin，然后每孔加入终止液50 μ L以终止反应，轻轻振荡混匀，最后用酶标仪测定各孔的 〇〇咖值。
[0125] 用每个浓度的磺胺二甲基嘧啶溶液的吸光度平均值（B)除以阴性对照孔的吸光 度值（Β。）再乘以100%，得到百分吸光度值。
[0126] 百分吸光度值=2 X 100% %
[0127] 以标准品溶液浓度（ng/mL)为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线（图6)， 当B/B。为50%时，所对应的标准品溶液的浓度即为半抑制率（IC 5。）。由ELISA方法的标准 曲线可见，磺胺二甲基啼啶对蛋白质flop的半数抑制量（IC5。）为9. 03ng/mL，最低检测限 (LOD)为4. 82ng/mL，在5. 61-14. 59ng/mL范围内，抑制率与磺胺二甲基嘧啶标准品溶液浓 度的对数值呈显著的线性关系，相关系数为r = 0. 999。与阴性对照（未加磺胺二甲基嘧啶 标准品溶液）相比，加入磺胺二甲基嘧啶标准品溶液后，吸光值呈明显的递减梯度，说明获 得的蛋白质flop能够特异性地识别磺胺二甲基嘧啶标准品，对磺胺二甲基嘧啶标准品具 有较高的亲和力。
[0128] 二、蛋白质flop的特异性试验
[0129] 采用样品稀释液分别溶解磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺 胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、 磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲 基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁挫、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺 硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑等磺胺药物样品，配置 成如下浓度梯度的溶液：50ng/mL、25ng/mL、12. 5ng/mL、6. 25ng/mL、3. 125ng/mL 和 I. 6ng/ mL。按照步骤一中的操作方法分别计算磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡 啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺林、磺胺索嘧啶、 磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲 基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁挫、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺 硝苯、磺胺啼啶、磺胺溴二甲啼啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑样品对蛋白质f 10 P 的半数抑制量（IC5。）分别为 2. 95ng/mL、4. 58ng/mL、4. 92ng/mL、5. 28ng/mL、5. 75ng/mL、 6. 37ng/mL、6. 66ng/mL、6. 68ng/mL、7. 08ng/mL、7. 22ng/mL、7. 39ng/mL、7. 44ng/mL、7. 86ng/ mL、8. 07ng/mL、8. 39ng/mL、8. 78ng/mL、8. 84ng/mL、9. 03ng/mL、10. 02ng/mL、10. 69ng/mL、 11. 93ng/mL、14. 09ng/mL、20. 43ng/mL、21. 79ng/mL、25. 83ng/mL、28. 75ng/mL、31. 24ng/mL、 54. 42ng/mL、56. 22ng/mL样品对蛋白质flop的半数抑制量（IC5。）的数值）及磺胺二甲基嘧 啶标准品与磺胺异噁唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧 啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺（二）甲 噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲 氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺 胺溴（二）甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞磺胺噻唑样品的交叉反应率，交叉反应率的公 式为：交叉反应率（％) =(引起蛋白质flop 50%抑制的磺胺二甲基啼啶标准品的浓度/ 引起蛋白质flop 50%抑制的其它磺胺药物的浓度）X 100%。实验设三次重复。
[0130] 结果见表1，蛋白质flop可以识别包括磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻 唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑等在内的至少29种磺胺药物。
[0131] 表1、多种磺胺药物的交叉反应率
[0132]
【主权项】
1. 重组大肠杆菌，其特征在于：所述重组大肠杆菌是大肠埃希氏菌（Escherichia C〇li)BL21(DE3)-pET28b-fl 〇p，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登 记入册编号为CGMCC No. 10068。2. 构建重组大肠杆菌的方法，包括将蛋白质flop的编码基因导入受体大肠杆菌中得 到产所述蛋白质flop的重组大肠杆菌； 所述蛋白质flop为如下a)或b)的蛋白质： a) 由SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将SEQ ID No. 1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加得到的具有蛋白质flop活性的由a)衍生的蛋白质。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述蛋白质flop的编码基因为如下1)或 2)或3)的核酸分子： 1) 其编码序列是SEQ ID No. 2的DNA分子或cDNA分子； 2) 在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质flop的DNA分子或cDNA 分子； 3) 与1)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码所述蛋白质flop的 DNA分子或cDNA分子。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述蛋白质flop的编码基因通过重 组表达载体导入所述受体大肠杆菌中。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述受体大肠杆菌为大肠杆菌 BL21 (DE3);所述重组表达载体是将所述蛋白质flop的编码基因插入载体pET-28b (+)的多 克隆位点得到的重组表达载体。6. 根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组大肠杆菌为权利要求1 所述的重组大肠杆菌。7. 由权利要求2-5中任一所述方法构建的重组大肠杆菌。8. 权利要求2所述蛋白质flop的制备方法，包括培养权利要求1所述的重组大肠杆菌 或权利要求7所述的重组大肠杆菌，得到权利要求2所述蛋白质flop。 9?下述1)-8)中的任一种应用： 1) 权利要求1所述的重组大肠杆菌在生产权利要求2所述蛋白质flop中的应用； 2) 权利要求2-5中任一所述的方法在生产权利要求2所述蛋白质flop中的应用； 3) 权利要求7所述重组大肠杆菌在生产权利要求2所述蛋白质flop中的应用； 4) 权利要求1所述重组大肠杆菌在检测磺胺药物中的应用； 5) 权利要求2所述蛋白质flop在检测磺胺药物中的应用； 6) 权利要求2-5中任一所述的方法在检测磺胺药物中的应用； 7) 权利要求7所述的重组大肠杆菌在检测磺胺药物中的应用； 8) 权利要求8所述的制备方法在检测磺胺药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述磺胺药物为磺胺异噁唑、柳氮磺胺 吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺吡啶、磺胺甲二唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺噻唑、磺胺苯酰、磺胺喹噁 啉、磺胺甲氧吡嗪、磺胺索嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲噁唑、磺胺氯哒嗪、磺胺乙氧哒嗪、磺胺甲 氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲基嘧啶、 磺胺胍、磺胺间甲氧哒嗪、磺胺硝苯、磺胺嘧啶、磺胺溴二甲嘧啶、氨苯磺胺、磺胺多辛和酞 磺胺噻唑中的全部或部分任一种。
【专利摘要】本发明公开了产能检测磺胺药物的蛋白质的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。采用本发明的方法构建筛选获得的大肠埃希氏菌(Escherichia？coli)BL21(DE3)-pET28b-flop(即为BL21-pET28b-flop-7菌株)，具有最高的蛋白质flop产率，适于作为蛋白质flop的生产菌株，该菌株表达的蛋白质flop对于磺胺二甲基嘧啶标准品的检测限为4.82ng/mL，可以识别包括磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲噻唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑等在内的至少29种磺胺药物。CGMCC No.1006820141127
【IPC分类】C12R1/19, G01N33/68, C12N15/70, C12P21/02, C12N1/21
【公开号】CN105018406
【申请号】CN201510455258
【发明人】王战辉, 沈建忠, 梁晓, 张素霞, 温凯, 江海洋, 李成龙
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2015年7月29日