白质条带（图4中B和C)， BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤二中的上清液和步骤三中的纯化后的蛋白质溶液中均 不含有分子量为35KDa的蛋白质条带，结果表明在IPTG诱导下，BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌 株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株和 BL21-pET28b-flop-8菌株表达了与目的蛋白质分子量大小一致的蛋白质。
[0085] 2、Western blot 验证
[0086] 分别将 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、 BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、 BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和BL21菌株的步骤二中的OD6。。为0. 6-0. 8的未诱导菌体的菌液，步骤二中的上述 菌株的上清液和步骤三中的上述菌株纯化后的蛋白质溶液分别进行10% SDS-PAGE电泳； 将电泳条带印迹到NC膜上，再依次与His-tag单克隆抗体以及HRP标记的羊抗鼠抗体杂 交，进行 DAB 显色。结果如图 5 所示，BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌 株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、 BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株、BL21-pET28b-flop-8 菌株、BL21-CK 菌株和BL21菌株的步骤二中的0D_为0.6-0. 8的未诱导菌体的菌液中均不含有分子 量为 35KDa 的蛋白质条带（图 5 中 A) ;BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌 株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株和 BL21-pET28b-flop-8 菌株 的步骤二中的上清液和步骤三中的纯化后的蛋白质溶液中均含有分子量为35KDa的蛋 白质条带（图5中B和C)，BL21-CK菌株和BL21菌株的步骤二中的上清液和步骤三中 的纯化后的蛋白质溶液中均不含有分子量为35KDa的蛋白质条带，结果表明在IPTG诱 导下，BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌 株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、 BL21-pET28b-flop-7菌株和BL21-pET28b-flop-8菌株表达了与目的蛋白质分子量大小一 致的蛋白质。
[0087] 上述结果表明 BL21-pET28b-flop-l 菌株、BL21-pET28b-flop-2 菌株、 BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、BL21-pET28b-flop-5 菌株、 BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株和 BL21-pET28b-flop-8 菌株成功表 达了蛋白质flop。
[0088] 五、蛋白质flop的定量
[0089] 采用BCA蛋白定量试剂盒测定步骤三获得的BL21-pET28b-flop-l菌株、 BL21-pET28b-flop-2 菌株、BL21-pET28b-flop-3 菌株、BL21-pET28b-flop-4 菌株、 BL21-pET28b-flop-5 菌株、BL21-pET28b-flop-6 菌株、BL21-pET28b-flop-7 菌株和 BL2l-pET28b-flop-8菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质flop的总量。测定方法参 照BCA蛋白定量试剂盒的说明书进行，BL21-pET28b-flop-l菌株纯化后的蛋白质溶液 中蛋白质flop的总量为2. 27mg、BL21-pET28b-flop-2菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋 白质flop的总量为3. 36mg、BL21-pET28b-flop-3菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质 flop的总量为2. llmg、BL21-pET28b-flop-4菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质flop 的总量为2.02mg、BL21-pET28b-flop-5菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质flop的总 量为2. 54mg、BL21-pET28b-flop-6菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质flop的总量为 2. 33mg、BL21-pET28b-fl〇p-7菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质flop的总量为3. 87mg和 BL21-pET28b-flop-8菌株纯化后的蛋白质溶液中蛋白质flop的总量为2. 08mg，由此可见 由BL21-pET28b-flop-7菌株诱导表达得到的蛋白质flop的总量最高。
[0090] 利用BL21-pET28b-flop-7菌株按照上述方法制备蛋白质flop，实验重复3次， 3次结果平均分别为3. 86mg、3. 84mg、3. 98mg，表明BL21-pET28b-flop-7菌株产生蛋白质 flop的稳定性好，适用于蛋白质flop的生产。
[0091] 六、BL21-pET28b-flop-7 菌株的保存
[0092] 从转化平板中挑取BL21-pET28b-flop-7菌株的单克隆菌落，加入到2mL含有卡那 霉素（浓度为30 μ g/mL)的LB液体培养基中，培养4h至菌液略呈混浊；在含有卡那霉素 (浓度为30 μ g/mL)的平板上划线，37°C培养20h，取单克隆菌落，接种入2mL含有卡那霉素 (浓度为30 μ g/mL)的LB液体培养基中，培养至0D_达到0· 6时，将0· 9mL的OD 6。。为0· 6 的BL21-pET28b-flop-7菌株的菌液与0· ImL 80% (体积百分比）甘油混和，存于-70°C冰 箱中。
[0093] 重组大肠杆菌BL21-pET28b-flop-7于2014年11月27日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC)，其在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 10068。重组大肠杆菌BL21-pET28b-flop-7 在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心参据的生物材料（株）为 BL21(DE3)-pET28b-flop。
[0094] 实施例3、用蛋白质flop检测磺胺药物的活性检测
[0095] 本实施例中各个试剂的配置如下：
[0096] 浓度为 0. 05M，pH 值为 7. 0 的 PBS 缓冲液的配制：溶液 A :17. 9g Na2HPO4 ·12Η20, IL 去离子水，得到浓度为〇. 05Μ的Na2HPO4溶液；溶液B :8. 6g KH 2Ρ04 ·2Η20, IL去离子水，得到 浓度为〇. 05Μ的KH2PO4溶液；取60mL溶液A和40mL溶液Β，加入8. 5g NaCl，混合均匀。
[0097] 浓度为 0· 01M，pH 值为 7. 4 的 PBS 缓冲液的配制：8g NaCl、0. 2g KC1、3. 53g Na2HPO4 · 12H20、(λ 24g KH2PO4, IL 去离子水。
[0098] 浓度为0· 1M，pH值为L 2的PBS缓冲液的配制：溶液C :35. 8g Na2HPO4 · 12H20, IL 去离子水，得到浓度为〇. IM的Na2HPO4溶液；溶液D :15. 6g NaH2PO4 · 2H20, IL去离子水，得 到浓度为〇. IM的NaH2P04溶液；将72mL溶液C和28mL溶液D混合后加入8. 5g NaCl混合 均匀。
[0099] 浓度为0. 02M，pH值为7. 2的PBS缓冲液的配制：取浓度为0. 1M，pH值为7. 2的 PBS缓冲液200mL，加入去离子水800mL，混匀。
[0100] 浓度为0. 05M，pH值为9. 6的碳酸钠溶液的配制：I. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,加 水定容至1L。
[0101] 底物显色液：由E液和F液组成；E液为2 % (质量百分含量）过氧化脲的水溶液， F液为1 % (质量百分含量）四甲基联苯胺的水溶液；将溶液E与溶液F按照I : I (v/v)的 比例混合。
[0102] 终止液：浓度为0. 2M的硫酸水溶液。
[0103] 洗涤液：0· 5mL吐温20、5g叠氮化钠，990mL浓度为(λ 01M，pH值为L 4的PBS缓冲 液。
[0104] 样品稀释液：pH值为8. 0,由溶剂和溶质组成；溶剂为水，溶质及其浓度为：20mM 1^8、5禮1%(：12、2%(质量百分含量）脱脂奶粉、1:1500(￥/￥)的6-羟甲基-7,8二氢蝶呤 焦磷酸盐（DHPPP)。
[0105] 包被缓冲液：pH值为8.0,由溶剂和溶质组成，溶剂为水；溶质及其浓度为： 20mMTris、30mM MgCl2。
[0106] 封闭液：20g脱脂奶粉，用浓度为0. 01M，pH值为7. 4的PBS缓冲液溶解并定容至 IL0
[0107] 酶标物-HRP标记的半抗原（4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸，CS)的配置方法 如下：
[0108] a.将半抗原4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸溶于ImL DMF中，配置成浓度为 0. 2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸溶液；
[0109] b.在ImL浓度为0. 2mM的4-(4-氨基-苯磺酰胺基）苯甲酸溶液中依次加入二环 己基碳二亚胺（DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，使得DCC的浓度为0. 3mM，NHS的浓度为 0. 6mM，将此混合液在室温下搅拌2h，获得溶液G ;
[0110] c.取IOmg的HRP溶解于2mL浓度为0· 05M，pH值为9. 6的碳酸钠溶液中，室温搅 拌至HRP溶解，获得溶液H ;
[0111] d.将溶液G和