CC)，而3'端带有HindIII(AAGCTT)。将合成的带有gmas基因的 pU巧7-gmas载体质粒和表达载体质粒祀T-32a分别用BamHI和化ndlll进行双酶切（限制性 内切酶购自Takara公司），利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收卵as基因片段和祀T-32a 载体骨架，然后用T4DNA连接酶将卵as基因片段和祀T-32a载体骨架连接起来。连接体系 为 10yL:
[0092] 巧wa,.s，基因片段 斗
[0093] pET-32a载体骨架 0 5,liL 10XBuffer 4uL T4DNAligase 1.片L
[0094] 16°C连接过夜后。
[0095] 3、重组大肠杆菌的构建
[0096] 将10yL的连接产物转化至大肠杆菌D册a感受态细胞中。
[0097] 转化过程为：
[0098] 取1管50iiL的大肠杆菌D册a感受态细胞，置于冰上，待其融化后，向其中加入 10yL的连接产物转，在冰上放置30min后，42°C热激90s，马上置于冰上2min后，在无菌 环境下，涂布于Amp抗性LB固体平板上，37°C恒溫培养箱倒置培养12h-16h，挑取单克隆 菌落于5LB液体培养基（含Amp100yg/mL)，37°C，220巧m培养1化后，提取质粒进行酶 切（如附图1所示），将验证正确的单克隆菌液进一步进行测序验证，获得gmas基因序列 完全正确的单克隆转化子，从而得到祀T-32a-gmas重组质粒，重组质粒图谱如附图2。将 祀T-32a-gmas重组质粒转化至大肠杆菌表达菌株Transetta(DE3)感受态细胞中，获得重 组大肠杆菌Transetta(DE3) /pET-32a-gmas。
[009引Amp抗性LB固体平板中含有：1 %膜蛋白腺，0. 5%酵母提取物，1 %氯化钢，1. 5% 琼脂粉，氨节青霉素100yg/mL。
[0100] 4、重组大肠杆菌中gmas基因的诱导表达
[0101] 用接种环挑一环重组大肠杆菌Transetta(DE3)/pET-32a-gmas甘油菌，在含氨节 青霉素的LB固体培养基平板上划线，37°C恒溫倒置培养12~16h。挑取单菌落，接种于含 5血LB液体培养基（含氨节青霉素lOOiig/血）的试管中，37°C、22化pm培养6~化。随 后，将试管中的菌种接种（接种量为5%)于50mTB培养基（含氨节青霉素lOOiig/mL)中， 当菌浓度培养至0D600为0. 8~1. 2时，开始添加适量的IPTG(异丙基-P-D-半乳糖巧）， 降溫至22~30°C诱导15~20h。SDS-PAGE检测GMAS蛋白的表达量及表达的形式，如附图 3所示，GMAS蛋白大小为64. 23kDa，主要W可溶蛋白和包涵体两种形式表达，其中可溶蛋白 约占总蛋白的65%~70%。
[0102]LB液体培养基中含有（％) :1%膜蛋白腺，0. 5%酵母提取物，1%氯化钢，PH7.0~ 7. 2。
[0103] 5、转化实验
[0104] 将诱导培养的菌液在6000rpm，4°C离屯、lOmin，弃去上清液，收集湿菌体。将收集 的湿菌体投入到生物转化体系（转化体系：150mM谷氨酸钢，150mM乙胺盐酸盐，15mM六水 氯化儀，5mM氯化儘和5mMAT巧中，在30°C，200巧m条件下进行反应35~45h。然后取转 化液经过沸水浴5~lOmin，使得酶蛋白变性失活，再经过高速离屯、去除酶蛋白，通过HPLC 检测上清液中k茶氨酸的浓度，结果显示重组大肠杆菌化ansetta(DE3) /pET-32a-gmas经 酶法转化k茶氨酸的产量达到12. 2g/l，转化率达到46. 74%。
[0105] 实验例
[0106] 对实施例3、4、5的转化k茶氨酸的产量、转化效率、生产周期、菌种使用时间进行 统计：
[0107]
[010引由此可见，本申请所提供的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法，生产k茶氨 酸产量稳定，转化效率较高，且生产周期在本领域中相对较短，菌种效果稳定，可反复使用。
[0109] 尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的 精神和范围的情况下可W作出许多其它的更改和修改。因此，运意味着在所附权利要求中 包括属于本发明范围内的所有运些变化和修改。
【主权项】
1. 一种Y-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，其特征在于，所述表达质粒上的 Y-谷氨酰甲胺合成酶的碱基序列为SEQIDNO: 1所示。2. -种如权利要求1所述的y-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法， 其特征在于，包括以下步骤： 1) 、针对大肠杆菌表达系统对MethylovorusmaysNO. 9来源的GenBankAccession号 为AB333782. 1的y-谷氨酰甲胺合成酶基因原始序列进行优化，将原始序列中的低频密码 子转换为同义的大肠杆菌高频密码子，将原序列中的终止子替换成TAAT强终止子，在原序 列两端添加上了限制性内切酶的酶切位点，得到优化的gmas基因序列； 2) 、以优化的gmas基因序列为模板，合成碱基序列为SEQIDNO: 1所示的gmas基因片 段； 3) 、将所述优化的gmas基因片段连接到原核表达载体上，得到y-谷氨酰甲胺合成酶 的大肠杆菌表达质粒。3. 如权利要求2所述的Y_谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特 征在于，步骤3)的具体步骤为： 将所述的gmas基因片段连接到克隆载体上，得到克隆载体-gmas; 对克隆载体-gmas进行扩增； 将gmas基因片段从克隆载体-gmas上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的 表达载体上，构建获得的重组载体即为T-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒。4. 如权利要求3所述的Y_谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒的构建方法，其特 征在于： 所述克隆载体为PUC57 ; 所述表达载体为pET-32a。5. -种茶氨酸基因工程菌，其特征在于，所述茶氨酸基因工程菌是由权利要求1所述 的质粒转化至大肠杆菌表达菌株中所得到。6. 如权利要求5所述的茶氨酸基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌表达菌株为 Transetta07. -种如权利要求5或6所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征 在于，包括如下步骤： 1) 、将所述基因工程菌进行接种于含有所述工程菌所转入的所述质粒具有抗性对应的 抗生素的LB固体选择培养基上进行筛选培养，筛选出抗性菌株； 2) 、将所述抗性菌株进行诱导培养，以诱导gmas基因表达；在所述培养过程中，用 SDS-PAGE方法检测y-谷氨酰甲胺合成酶的表达情况，检测合格后通过低温离心所述发酵 培养基获得湿菌体； 3) 、利用所述湿菌体在生物转化反应体系中进行催化底物生成L-茶氨酸。8. 如权利要求7所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在 步骤1)中，所述筛选培养的培养条件为： 36~38°C恒温倒置培养12~16h。9. 如权利要求7所述的茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在 步骤2)中，所述诱导培养的具体培养过程为： 将步骤1)中筛选出的抗性菌株接种于含与所述质粒具有抗性对应的抗生素的LB液体 培养基中，36~38°C，200~240rpm培养6~8h;随后将菌种接种于含与所述质粒具有抗 性对应的抗生素的TB培养基中，当菌浓度培养至0D600为0. 8~1. 2时添加诱导剂，降温 至22~30°C诱导15~20h。10.如权利要求8所述茶氨酸基因工程菌用于生产L-茶氨酸的方法，其特征在于，在所 述的生物转化反应体系中： 催化底物反应液中包括：130~180mM谷氨酸钠、130~180mM乙胺盐酸盐、10~20mM六水氯化镁、3~8mM氯化猛、3~8mMATP; 培养温度为28~32°C，摇菌转速为100~300rpm，培养时间为35~45h。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体而言，涉及一种用于茶氨酸生产的质粒及其相应工程菌的构建与使用方法，本发明提供一种γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒，所述质粒中的目的基因序列经过了优化，在大肠杆菌中表达效率高，其中的γ-谷氨酰甲胺合成酶基因表达出的γ-谷氨酰甲胺合成酶本身活性就很高，可解决现有的用于茶氨酸的酶活性低下的问题；而且其催化的底物为低成本的谷氨酸和乙胺，可解决现有技术底物成本较高的问题。本发明还提供了一种茶氨酸基因工程菌及其配套的培养方法，该基因工程菌由γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌表达质粒转化得到，可用于生产茶氨酸，易于培养，可解决现有菌株不够稳定的缺点。
【IPC分类】C12N1/21, C12N15/70, C12P13/04, C12N15/66
【公开号】CN105200075
【申请号】CN201510755912
【发明人】李晚军, 王钦芳, 范明, 陈纹锐
【申请人】四川同晟生物科技有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月9日