、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99、100个或更多个来自本文中提供的序列的任何序列的连续氨基酸或此类序列的组合。 [0033] 在其它方面，本发明的实施方案的抗体或多肽包含一个或多个本文中公开的氨基 酸序列的任何氨基酸序列的一个或多个氨基酸区段。例如，所述抗体或多肽可包含1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸区段，所述氨基酸区段包含长度为约、至少或至多5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、 58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、 106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、 125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、 144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、 163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、 182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199 或 200 个氨基酸，包括其间的所有值和范围，所述区段与本文中公开的氨基酸序列的任何氨基酸 序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100%同一性。在某些方面，所述氨基酸区段选 自如表6或图表1中提供的HER3结合抗体的氨基酸序列之一。
[0034] 在其它方面，本发明的实施方案的抗体或多肽包含本文中公开的氨基酸序列的 任何氨基酸序列的氨基酸区段，其中所述区段始于本文中提供的任何序列中的氨基酸位 置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 至 25、26、 27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、 102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、 140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、 159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、 178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、 197、198、199或200并且终于所述提供的同一序列中的氨基酸位置4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、 109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、 128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、 147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、 166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、 185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199 或 200。在某些方面， 所述区段或其部分选自如表6或图表1中提供的HER3结合抗体的氨基酸序列之一。
[0035] 在其它方面，本发明的实施方案的抗体或多肽包含与HER3-结合抗体的V、VJ、 VDJ、D、DJ、J或CDR结构域（如表6和图表1中提供的）具有至少80、85、90、95、96、97、98、 99或100%同一性（或可源自其中的任何范围）的氨基酸区段。例如，多肽可包含1、2或 3个与如表6和图表1中提供的HER3结合抗体的CDR1、2和/或3具有至少80、85、90、95、 96、97、98、99或100%同一性（或可源自其中的任何范围）的氨基酸区段。
[0036] 可针对本文中描述的任何其它方法或组合物应用在本发明的方法和/或组合物 的上下文中论述的实施方案。因此，关于一个方法的组合物的实施方案同样可用于本发明 的其它方法和组合物。
[0037] 如本文中在说明书中所用，"一个（a)"或"一种（an)"可意指一个或多个。如本文 中在权利要求中所用，当与单词"包含"结合使用时，单词"一个（a)"或"一种（an)"可意 指一个或超过一个。
[0038] 除非明确地指明指仅替代方案或替代方案是互斥的，否则权利要求中术语"或"的 使用用于意指"和/或"，虽然本公开内容支持指仅替代方案和"和/或"的定义。如本文中 所用，"另一个"可指至少第二个或更多。
[0039] 在整个本申请中，术语"约"用于表示值包括装置、用于测定值的方法的固有误差 变化或存在于研究受试者之间的变化。
[0040] 根据下列详细描述本发明的其它目的、特性和有利方面将变得显然。然而，应理 解，所述详细描述和特定实施例（虽然显示本发明的优选实施方案）仅通过举例说明的方 式给出，因为根据本详细描述，本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域普通 技术人员将变显然。
[0041] 附图简述
[0042] 下列附图形成本说明书的部分并且被包括来进一步例证本发明的某些方面。通过 结合本文中所示的特定实施方案的详细说明参考这些附图的一个或多个可更好地理解本 发明。
[0043] 图L抗体选择的工艺流程。
[0044] 图2.用于兔Fab表达的菌体展示载体。
[0045] 图3.使用表达异源HER3的CHO细胞进行的抗-Her3抗体对人和小鼠 HER3/ErbB3 的结合。
[0046] 图4.纯化的抗-Her3IgG在HER3磷酸化的抑制测定中的剂量反应。
[0047] 图5. HER3Mab IgG在MCF7细胞中产生的pAKT和pERK抑制。
[0048] 图6.使用α筛选格式和图表的配体阻断测定显示抗-HER3抗体的剂量反应。
[0049] 图7.抗HER3抗体对MCF7细胞的NRG诱导的细胞生长的抑制。数据显示为由抗 体导致的相对于无抗体对照减少的百分比。
[0050] 图8.通过ELISA测定的人源化HER3单克隆抗体对HER3E⑶的浓度依赖性结合。
[0051] 图9.通过Biacore测定的人源化HER3单克隆抗体对HER3ECD的动力学结合亲和 力。
[0052] 图10.人源化HER3单克隆抗体在T47D癌细胞中对pHER3的浓度依赖性抑制。
[0053] 图11.人源化HER3单克隆抗体对CWR22癌细胞增殖的浓度依赖性抑制。
[0054] 图12.人源化HER3单克隆抗体对MCF-7癌细胞增殖的浓度依赖性抑制。
[0055] 举例说明性实施方案的描述
[0056] I.本发明的抗体
[0057] 在某些实施方案中，设想结合HER3蛋白的至少部分并且抑制HER3信号转导和癌 细胞增殖的抗体或其片段。如本文中所用，术语"抗体"意欲广泛地指任何免疫结合剂，诸如 IgG、IgM、IgA、IgD、IgE和经遗传修饰的IgG，以及包含保留抗原结合活性的抗体CDR结构 域的多肽。所述抗体选自嵌合抗体、亲和成熟抗体、多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、 人抗体或抗原结合抗体片段或天然的或合成的配体。
[0058] 优选地，抗-HER3抗体是单克隆抗体或人源化抗体。实际上本文中所示的研究表 明可将HER3-结合抗体的鉴定的CDR置于人框架中，并且所得的人源化抗体保持对于HER3 的高亲和力（图8-9)。重要地，人源化抗体还高效地抑制HER3信号转导（图10)并且能够 抑制HER3阳性癌细胞的癌细胞复制（图11-12)。因此，本文中提供的HER3结合抗体，特别 地人源化抗体，是新的抗癌治疗剂的有前景的候选者。
[0059] 因此，通过已知的方法和如本文中所描述的，可产生对于HER3蛋白、其各自表位 的一个或多个表位或任何前述表位的缀合物（无论此类抗原或表位是从天然来源分离的 还是天然化合物的合成衍生物或变体）是特异性的多克隆或单克隆抗体、抗体片段以及结 合结构域和CDR (包括任何前述物质的工程化形式）。另一种变异是其中一条重链靶向HER3 并且另一条重链靶向不同癌细胞靶诸如HER2、EGFR、IGF1R、cMet或其它细胞表面靶的双特 异性抗体的构建。
[0060] 适合用于本发明的实施方案的抗体片段的实例包括，但不限于：（i)由\、VH、Q和 Chi结构域组成的Fab片段；（ii)由Vh和C H1结构域组成的"Fd"片段；（iii)由单个抗体的 \和C H结构域组成的"Fv"片段；（iv)由V H结构域组成的"dAb"片段；(V)分离的⑶R区； (vi)F(ab'）2片段，包含两个连接的Fab片段的双价片段；（vii)单链Fv分子（"8(^，)，其 中Vh结构域与\结构域通过允许两个结构域结合以形成结合结构域的肽接头连接；(viii) 双特异性单链Fv二聚体（参见美国专利No. 5, 091，513);和（ix)双链抗体，通过基因融合 构建的多价或多特异性片段（美国专利申请公开20050214860)。Fv、scFv或双链抗体分子 可通过掺入连接Vh和V #吉构域的二硫桥来稳定。还可产生包含连接于CH3结构域的scFv 的微抗体（Hu等人，1996)。
[0061] 抗体样结合拟肽也被包含在实施方案中。Liu等人（2003)描述了"抗体样结合拟 肽"（ABiP)，其为用作简化抗体并且具有更长的血清半衰期以及不太繁冗的合成方法的某 些有利方面的肽。
[0062] 可用抗原诸如HER3细胞外结构域蛋白（NCBI登录号M34309的氨基酸1-643)接种 动物，以产生对于HER3蛋白是特异性的抗体。经常地将抗原结合或缀合于另一种分子以增 强免疫应答。如本文中所用，缀合物是结合于用于引发动物的免疫应答的抗原的任意肽、多 肽、蛋白质或非蛋白质性质的物质。动物中响应抗原接种产生的抗体包含从多种单个抗体 生成B淋巴细胞产生的多种非相同分子（多克隆抗体）。多克隆抗体是抗体种类的混合群 体，所述抗体种类的每一种可识别相同抗原上的不同表位。给定用于在动物中产生多克隆 抗体的正确条件，动物血清中的大多数抗体将识别动物已被其免疫的抗原性化合物上的集 体表位。该特异性通过亲和纯化以仅选择识别目标抗原或表位的那些抗体来进一步增强。
[0063] 单克隆抗体是其中每一个抗体分子识别相同表位（因为所有抗体生成细胞来源 于单个B淋巴细胞系）的单种抗体。用于产生单克隆抗体（Mb)的方法通常沿着与用于制 备多克隆抗体的那些路线相同的路线开始。在一些实施方案中，将啮齿类动物诸如小鼠和 大鼠用于产生单克隆抗体。在一些实施方案中，兔、绵羊或蛙的细胞用于产生单克隆抗体。 大鼠的使用是公知的并且可提供某些有利方面。小鼠（例如，BALB/c小鼠）被常规地使用 并且通常提供高百分比的稳定融合物。
[0064] 杂交瘤技术包括来自先前用HER3抗原免疫的小鼠的单个B淋巴细胞与永生化骨 髓瘤细胞（通常地小鼠骨髓瘤）的融合。该技术提供扩增单个抗体生成细胞无穷数目代的 方法，以便可产生无限量的具有相同抗原或表位特异性的结构相同的抗体（单克隆抗体）。 [0065] 血浆B细胞可分离自被免疫的兔的新鲜制备的兔外周血单核细胞，并且被进一步 选择用于HER3结合细胞。在富集抗体生成B细胞后，可分离总RNA并合成cDNA。可扩增 来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列，将其构建入噬菌体展示Fab表达载体，并转化进 大肠杆菌（E. coli)。可通过多轮富集淘选选择出HER3特异性结合Fab，并对其进行测序。 可将选定的HER3结合命中在兔中表达为全长IgG和使用哺乳动物表达载体系统将其在人 胚胎肾（HEK293)细胞（Invitrogen)中表达为兔/人嵌合形式，并利用快速蛋白液相色谱 (FPLC)分离单位使用蛋白G树脂进行纯化。
[0066] 在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如，包含移植至非人序列、人序列或人源 化序列（例如，框架和/或恒定结构域序列）的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。已 开发方法来用人来源的类似结构域替代单克隆抗体的轻链和重链恒定结构域，从而保持外 来抗体的可变区完整。或者，在人免疫球蛋白基因的转基因小鼠中产生"完全人"单克隆抗 体。也已开发方法来通过重组构建具有啮齿类动物例如小鼠和人氨基酸序列的抗体可变 结构域来将单克隆抗体的可变结构域转变成更具人形式。在"人源化"单克隆抗体中，仅 高变CDR来源于小鼠单克隆抗体，并且框架和恒定区来源于人氨基酸序列（参见美国专利 No. 5, 091，513和6, 881，557)。据认为用在人抗体的对应位置中发现的氨基酸序列替代为 啮齿类动物的特征的抗体中的氨基酸序列将在治疗使用过程中减小不利免疫反应的可能 性。还可将杂交瘤或其它产生抗体的其它细胞经历遗传突变或其它改变，这可以改变或可 以不改变由杂交瘤产生的抗体的结合特异性。
[0067] 用于在各种动物物种中产生单克隆抗体以及用于产生不同类型（包括人源化、 嵌合和完全人）的单克隆抗体的方法在本领域中是公知的并且是高度可预测的。例如， 下列美国专利和专利申请提供此类方法的使能描述：美国专利申请No. 2004/0126828和 2002/0172677 ;和美国专利 No 3, 817, 837、3, 850, 752、3, 939, 350、3, 996, 345、4, 196, 265、 4, 275, 149、4, 277, 437、4, 366, 241、4, 469, 797、4, 472, 509、4, 606, 855、4, 703, 003、 4, 742, 159、4, 767, 720、4, 816, 567、4, 867, 973、4, 938, 948、4, 946, 778、5, 021，236、 5, 164, 296、5, 196, 066、5, 223, 409、5, 403, 484、5, 420, 253、5, 565, 332、5, 571，698、 5, 627, 052、5, 656, 434、5, 770, 376、5, 789, 208、5, 821，337、5, 844, 091、5, 858, 657、 5, 861，155、5, 871，907、5, 969, 108、6, 05