最后一位碱基g/a对应A10染色体上FLC1基因的第3763位的SNP 位点。
[0050] 实施例2、FLC1-13859895G/A位点的分子标记在鉴定的早抽薹和晚抽薹材料中的 应用
[0051] 1、分子标记在鉴定的早抽薹和晚抽薹材料
[0052] 1)DNA提取
[0053] 常规CTAB法分别提取表1中105种待测白菜材料的基因组DNA。
[0054] 用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基 因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散； Nanodrop2100检测A260/280介于1. 8-2. 0之间（DNA样品没有蛋白污染）；A260/230介于 1.8-2.0之间（0嫩样品盐离子浓度低）；27011111没有明显的光吸收（0嫩样品没有酚污染）； 用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4~10ng/每样品。稀释DNA浓度 成为l〇ng/μ1备用，得到待测DNA。
[0055] 2)基于竞争性等位基因特异性PCR
[0056] 按照英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室）有限 公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验， 以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤 按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，ManualPart#15004070Rev.B进行。KASPar反 应在384微孔板或1536微孔板（Cat.No. 04729749001，Roche)中进行，反应体系为3ul或 lul〇
[0057] 具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板（4ng/ μ1) 1. 5ul，60°C烘干。然后在Kraken操作系统下利用Meridian加样工作站向每个反应 孔中加入lXMastermix(KBS-1016_002 或Cat.No.KBS-1016-011，Laboratoryofthe GovernmentChemist)与引物预混液（实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度 比6:6:15混合，各引物终浓度为10μM)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪 和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴系统Hydrocycler中进行，具体程序 为94°C预变性，15分钟；94°C，20秒（变性）一61°C_55°C，1分钟（复性&延伸：以touch down程序扩增10个循环，每循环降低0. 6°C) ;94°C，20秒（变性）一55°C，60秒继续扩增 26个循环。扩增结束后，利用BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型 不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
[0058] 结果如图1所示，结果显示分型效果良好，该标记能特异区分该位点为纯合GG、或 纯合AA或杂合G/A的材料；
[0059] 若待测白菜FLC1-13859895G/A位点的核苷酸为AA纯合，则待测白菜为早抽薹；
[0060] 若待测白菜FLC1-13859895G/A位点的核苷酸为GG纯合或G/A杂合，则待测白菜 为晚抽薹。
[0061] 2、抽薹检测
[0062] 将表1中的105份白菜遗传种质播种，检测抽薹指数，检测方法可参照如下文献中 记载：余阳俊等，大白菜室内苗期耐抽薹鉴定方法，中国蔬菜，2002。
[0063] 抽薹调查分级标准：0级，无蕾，短缩茎未见伸长；1级，有蕾，短缩茎长< 1cm; 3级，有蕾，短缩茎明显伸长，短缩茎长l-2cm;5级，抽薹，薹长2-5cm;7级，抽薹，薹 长> 5cm;9级，开花，薹长> 5cm。
[0064] 具体计算公式如下：
[0065]
[0066] 抽薹指数0-33. 3为晚抽薹材料，77. 7-100为早抽薹材料。
[0067] 结果如表1所示，在47份抽薹检测为晚抽薹材料中，分子标记鉴定 FLC1-13859895G/A位点为GG纯合的材料有35份，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点 为AA纯合的材料12份，经过抽薹常规验证，47种为晚抽薹，本发明方法的鉴定准确度为 74. 5% ；
[0068] 在58份抽薹检测为早抽薹材料中，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点为AA纯 合的材料有4份，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点为GG纯合的材料3份，杂合G/A位 点的有1份，经过抽薹常规验证，58种为早抽薹，本发明方法的鉴定准确度为93. 2%。
[0069] 表1为105份材料在FLC1-13859895G/A位点的基因分型及抽薹指数统计表
[0070]
[
[0074]
[0075] 表注：所有材料为自交六代以上纯合自交系。
[0076] 因此，可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的抽薹状态。
[0077] 对比例1、
[0078] 一、引物的设计合成
[0079] 根据FLC1-13859895G/A位点设计了其它两组检测引物。
[0080] 引物组1:
[0081] 上游引物FLC1-FF1 :GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGTTTTGGCTAGCCAGa;
[0082] 上游引物FLC1-FV1 :GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGTTTTGGCTAGCCAGg;
[0083] 下游引物FLC1-R1:AATCGGATCGAAACTTAAACCGTA(序列 3)。
[0084] 引物组2:
[0085] 上游引物FLC1-FF2:GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCATGTTTTGGCTAGCCAGa;
[0086] 上游引物FLC1-FV2 :GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCATGTTTTGGCTAGCCAGg;
[0087] 下游引物FLC1-R2:CGGATCGAAACTTAAACCGTAAC(序列 3)。
[0088] 二、应用
[0089] 采用实施例2的1的方法，不同的是将引物分别替换为对比例中的引物组1和引 物组2。
[0090] 对比例中的引物组1的检测结果如下表2和图2左图。
[0091] 对比例中的引物组2的检测结果如下表2和图2右图。
[0092] 表2为利用引物组1和引物组2对105份材料的基因分型及抽薹指数统计表
[0093]
[0094]
[0095]
[0096]
[0097]
[0098]
[0099] 表注："一"，未能分型。
[0100] 可以看出，这两组引物不能进行基因分型。
【主权项】
1. 检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或 辅助鉴定白菜的抽薹状态中的应用； 或检测白菜基因组中FLC1 -13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴 定或辅助鉴定白菜的抽薹状态产品中的应用。2. 检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或 辅助鉴定白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜中的应用； 或检测白菜基因组中FLC1 -13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴 定或辅助鉴定白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜产品中的应用。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测白菜基因组中 FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质包括由序列1所示的单链DNA分子、序 列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物组。4. 一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜品种的方法，包括如下 步骤：检测待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA、GG或GA，若所述待测 白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA，则所述待测白菜为或候选为早抽薹白 菜；若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为GG或GA，则所述待测白菜 为或候选为晚抽薹白菜。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测白菜基因组 FLC1-13859895G/ASNP位点基因型的方法为如下： 1) 直接测序； 2) 用引物对待测白菜进行等位基因特异性PCR ; 所述引物由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的 单链DNA分子组成。6. 根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述FLC1-13859895G/ASNP位 点为序列表中序列4中第182位核苷酸。7. 鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的引物，由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的 单链DNA分子和序列3所不的单链DNA分子组成。8. 鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的PCR试剂，为含有权利要求7所述的引物的PCR试 剂；所述引物中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10 yM。9. 鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的试剂盒，为含有权利要求7所述的引物或权利要求 8所述的试剂盒。10. -种鉴定或辅助鉴定待测白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜品种的方法，包括如下 步骤：用权利要求7所述的引物对待测引物进行等位基因特异性PCR，若所述待测白菜基因 组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA，则待测白菜为或候选为早抽薹白菜；若所述待 测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为GG或G/A，则待测白菜为或候选为晚抽 薹白菜； 所述等位基因特异性PCR的模板具体为待测白菜的基因组DNA。
【专利摘要】本发明公开了基于竞争性等位基因特异性PCR技术的FLC1特异SNP分子标记及应用，本发明提供了检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜的抽薹状态中的应用。本发明的实验证明了，开发的SNP标记特异引物可以对抽薹性状良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗抽薹遗传材料的预先选择和辅助育种。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105238869
【申请号】CN201510769744
【发明人】苏同兵, 于拴仓, 张凤兰, 余阳俊, 赵岫云, 张德双, 卢桂香, 隋光磊
【申请人】北京市农林科学院
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月11日