0028] 图4所示为斑点印迹实验检测赖氨酸单基丙酰化鼠源单克隆抗体特异性。每一 斑点印迹所对应的上样量为20纳克。1 :赖氨酸甲基丙酰化多肽库；2 :甲基丙酰化赖氨酸 小分子化合物；3 :赖氨酸甲基丙酰化GG多肽；4 :KLH偶联的甲基丙酰化赖氨酸小分子化合 物；5 :赖氨酸丙酰化多肽库；6 :赖氨酸丙酰化GG多肽；7 :赖氨酸甲基乙酰化多肽库；8 :赖 氨酸甲基乙酰化GG多肽；9 :赖氨酸甲基丁酰化多肽库；10 :赖氨酸甲基丁酰化GG多肽；11 : 未修饰的赖氨酸多肽库；12 :未修饰的赖氨酸GG多肽；13 :KLH。实验中所用多肽序列见表 3及表4。
[0029] 图5所示为斑点印迹实验检测赖氨酸单基丙酰化鼠源单克隆抗体特异性。。每一 斑点印迹所对应的上样量如图左标记所示。1 :赖氨酸甲基丙酰化多肽库；2 :赖氨酸丙酰化 多肽库；3 :赖氨酸丁酰化多肽库；4 :赖氨酸单甲基化多肽库；5 :赖氨酸二甲基化多肽库； 6 :赖氨酸三甲基化多肽库；实验中所用多肽序列见表1及表2。
[0030] 图6所示为竞争ELISA实验检测赖氨酸单基丙酰化鼠源单克隆抗体特异性特异 性。实验中所用多肽序列见表1及表2。
[0031] 详细说明
[0032] 定义
[0033] 除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的一般技 术人员所使用的术语具有相同的含义。
[0034] 赖氨酸的修饰和抗原的设计
[0035] 在一些优选的实施方式中，在赖氨酸单甲基化修饰的基础上，可以进一步对单甲 基化赖氨酸进行乙酰基、丙酰基或丁酰基的修饰，然后用经过双重修饰的小分子化合物 或多肽抗原来免疫动物可以获得特异识别赖氨酸单甲基乙酰化（Kme-ac)、单甲基丙酰化 (Kme-prop)或单甲基丁酰基化（Kme-buty)的抗体。
[0036] 通常，在对从生物体提取的蛋白样品进行胰酶裂解后，可对酶解多肽进行体外衍 生化反应，如丙酰化反应。如某条多肽中存在赖氨酸单甲基化修饰，则体外衍生化后将生成 赖氨酸单甲基化丙酰化多肽。然后再将经过衍生化反应的赖氨酸单甲基化丙酰化多肽和上 述开发的抗体孵育，根据抗原-抗体特异性亲和结合的特性，赖氨酸单甲基丙酰化抗体将 会特异性识别并富集赖氨酸单甲基化丙酰化多肽。经过酸洗脱将与抗体结合的赖氨酸单甲 基化丙酰化多肽洗脱，通过后继的质谱分析可知道赖氨酸单甲基丙酰化修饰的多肽序列与 修饰位点信息，而这些信息实际上对应的是赖氨酸单甲基化修饰的多肽序列与修饰位点， 最后通过进一步的蛋白质数据搜索可以获得赖氨酸单甲基化修饰的蛋白底物信息。
[0037] 在氨基酸上进行基团修饰是本领域一般技术人员所知晓的技术，这种修饰可以从 已经发现的修饰的自然生物体上进行分离和纯化，也可以人工进行体外修饰获得最终的经 过修饰的氨基酸。赖氨酸根据其属性，在体内很容易发生多种修饰，如乙酰化赖氨酸、甲基 化赖氨酸等。在体外，在优化的反应体系和反应条件下，也可以合成特定的赖氨酸修饰形 式，如单甲基乙酰化赖氨酸、单甲基丙酰化赖氨酸与单甲基丁酰化赖氨酸。这种人工合成的 修饰性赖氨酸小分子，一方面可以作为小分子抗原与必要的载体蛋白偶联免疫动物产生抗 血清，经过必要的抗体纯化工艺，可产生特异性识别该修饰赖氨酸的抗体。另一方面，以合 成的修饰性赖氨酸作为基本原料（rawmaterial)，进一步人工合成多肽抗原。该多肽抗原 与必要的载体蛋白偶联免疫动物后产生抗血清，经过必要的抗体纯化工艺，可产生特异性 识别该修饰赖氨酸的抗体。
[0038] 人工合成的含有修饰赖氨酸多肽抗原的长度可以是修饰性赖氨酸两侧各30个氨 基酸残基以内。优选的序列长度为CXnGGK*GGXn，其中X为19种常见氨基酸中除半胱氨酸 之外的任意氨基酸，η为1-20, ；K*为修饰性赖氨酸，优选K*选自甲基丙酰化、甲基乙酰化 或甲基丁酰化修饰性赖氨酸。在一些优选的实施方式中，Κ*为甲基丙酰化赖氨酸。在一些 优选的实施方式中，被修饰的氨基酸可以处于多肽序列的中间位置，也可处于该多肽抗原 偏氨基端（-ΝΗ2)或羧基端（-C00H)的位置。优选地，多肽抗原序列为CEGRGDSGGGK*GGSG。
[0039] 抗原多狀的合成
[0040] 修饰性赖氨酸多肽的合成为现有公知的技术。可以采用溶液法合成本发明的多 肽，也可以采用常用的固相合成法合成本发明的多肽。多肽的化学合成技术无论是液相 法还是固相法都已成熟。在一些优选的实施方式中，合成多肽的技术为固相合成法。1978 年，ChangMeienlofer和Atherton等人米用Carpino报道的Fmoc(9_荷甲氧撰基）作为 α氨基保护基，Fmoc基对酸很稳定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脱去。近年来，Fmoc 合成法得到了广泛的应用。在另一些优选的方式中，采用Fmoc合成法合成本发明的肽链 序列（Fmoc固相多肤合成-一种实用方法（FmocSolidPhasePeptideSynthesis) -A PracticalApproach.牛津大学出版社，2000)。
[0041] 采用Fmoc合成法合成本发明的肽链序列基本方法是：首先将一个用Fmoc基团对 α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保 护，用溶液洗涤氨基酸一支臂一树脂。将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦 联反应连接上去。此外，也可以用α-Ν端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联 反应，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、偶联，直到得到目的肽。最后将肽一 支臂一树脂裂解。这种延长肽链的固相合成法既可采用间断的方法，也可使用连续流动的 方法。
[0042] 抗体以及抗体的产牛
[0043] 这里的抗体是指通过利用本发明的修饰性赖氨酸小分子或修饰性赖氨酸多肽作 为抗原免疫动物获得抗体。
[0044] 在一些优选的实施方式中，在碳化二亚胺，如1-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二 亚胺盐酸盐?DC)存在的条件下，修饰性赖氨酸小分子的羧基端（-C00H)能与N-羟基琥 珀酰亚胺磺酸（Sulfo-NHS)反应，形成半稳定的Sulfo-NHS酯，接着与载体蛋白的氨基端 (-NH2)偶联（Taros,J.V.,等人，AnalBiochem，156:220-2 (1986))。本发明的小分子化合 物单甲基丙酰化赖氨酸（Lys(me-prop)-OH)，通过EDC介导，可以与一些载体蛋白-NH2端偶 联，形成活化全抗原来免疫动物。在多肽全抗原的准备过程中，载体蛋白上的氨基（-NH2)先 与4-(N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（sulfo-SMCC)反应， 形成稳定的肽键，随后与抗原多肽末端的半胱氨酸反应，通过二硫键形成稳定的复合物，由 此形成活化的全抗原来免疫动物。
[0045] 在一些优选的实施方式中，本发明的修饰性赖氨酸小分子或抗原多肽通过与载体 蛋白的偶联而活化，带有载体蛋白的修饰性赖氨酸小分子或多肽抗原具有更强的免疫活 性，因为单独的修饰性赖氨酸小分子或多肽序列本身通常不具有免疫活性或免疫活性很 低。偶联的载体蛋白可以是，但并不局限于血蓝蛋白（Keyholelimpethemocyanin，KLH)、 牛血清蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA)、卵清蛋白（Ovalbumin,OVA)、牛血红蛋白 (Bovinegammaglobulin,BGG)、牛甲状腺蛋白（BovineThyroglobulin，BTG)、抹香嫁肌 球素（SpermWhaleMyoglobin,SWM)、破伤风类毒素（TetanusToxoid,TT)、甲基化的牛 血清蛋白（MethylatedBovineSerumAlbumin,mBSA)、人免疫球蛋白IgG或IgA(Human immunoglobulinsIgG,IgA)或者其他现有技术的免疫原蛋白等等。
[0046] 用以上偶联有活性基团的修饰性赖氨酸小分子或多肽可以来免疫动物，例如鼠， 兔，或其他哺乳动物来生产多克隆抗体，也可以用杂交瘤细胞来产生单克隆抗体，这些方 法是本领域现有公知的技术，在此不再赘述，可以参见一些教科书或免疫手册来获得本发 明的抗体或抗体片段（制备和使用抗体-实用手册（MakingANDUsingAntibodies-A practicalhandbook).CRCPress, 2007)。当然，抗体也可以经过自然产生，也可以是经过人 工合成的抗体或抗体片段。这些抗体可以特异识别包括经过修饰的赖氨酸残基，而与其周 边序列无关。在一些优选的实施方式中，本发明的抗体可以特异识别某一含有单甲基丙酰 化修饰的赖氨酸多肽，而不能识别那些含有其他赖氨酸修饰形式的多肽。所谓"特异性"是 指该抗体仅能识别或结合某一特定类型的抗原，而不识别或结合其他类型的抗原。在本发 明中，所制备的抗体只是识别单甲基丙酰化修饰的赖氨酸的肽链序列，而不能识别其它类 型赖氨酸修饰的多肽序列，如包括但不局限于赖氨酸二甲基化，三甲基化，乙酰化、丙酰化、 丁酰化修饰，或其他氨基酸残基的修饰形式，如酪氨酸磷酸化等。
[0047] 作为结合或识别赖氨酸甲基丙酰化修饰的抗体可以是本发明的抗体。抗体可以是 免疫球蛋白分子或部分抗原特定位点的免疫球蛋白分子，例如那些具有抗原结合位点的分 子能够特异（被免疫）结合被分析物质，被分析物质的拟态物质或配体。抗体也包括人工 合成的杂交抗体或者经过修饰过的抗体或抗体分子片段，包括，但不局限于，抗体片段和Fv 片段。具有结合抗原功能的抗体上具有自然发生的