抗体上的一些片段。一个结合片段或抗 体片段包括，但不局限于，（i)Fab片段，它包括VL，VH，CL和CH1区域；（ii)Fd片段，它包括 VH和CH1区域（iii)Fv片段，它包括抗体的一个单链上的VL和VH区域；（iv)dAb区域（Ward etal.，Nature341:544-546 (1989)，它包括VH区域；（v) -个独立的决定簇（CDR) ; (vi) - 个F(ab'）2片段，一个二价片段包括两个通过二硫化物在铰链区连接的Fab片段。另外，虽 然这Fv片段上的两个区域是不同的基因编码所决定，人工合成的连接试剂可以让他们形 成单一的蛋白链（已知的单一Fv(scFv)链）（Bird等人，Science242:423-426 (1988);和 Huston等人，PNAS85:5879-5883 (1988))。蛋白片段包括那些可以交联结合他们的目标抗 原的片段，例如二价片段，如F(ab'）2片段。可选的，那些不能自我交联结合目标抗原的蛋 白片段也可与第二抗体一起结合目标抗原。
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。。
[0049] 本发明实施例中使用的试剂如下列表：
[0050] 表 1
[0051]
[0052] 本发明实施例中各种溶液配方如下：
[0053] 表 2
[0054]
[0055] 实施例1多克隆抗体的制备
[0056] 1、单甲基丙酰化赖氨酸小分子的合成（Lys(me-prop)-OH)的合成即在赖氨酸 ε-残基上连接甲基丙酰基基团，NHFMoc为保护基团）。
[0057] 合成路线：
[0059] 1)将148(0.029111〇1)2-1(^-叔丁氧羰基4-芴甲氧羰基4'-甲基-卜赖氨 酸，C27H34N206)用二氯甲烷（DCM)溶解，常温下持续通入新制HCL气体1. 5小时后，在HCL 强酸下常温继续反应5小时，薄层色谱TLC确认反应结束；50°C，0. 03MPa条件下旋干后，得 14. 7g粘稠固体，然后进行硅胶柱层析（洗脱剂比例：DCM-DCM:MeOH= 50:1-DCM:MeOH= 20:1)得到 10. 8g(0. 0283mol) 2-2 (N-芴甲氧羰基-Ν' -甲基-L-赖氨酸，C22H26N204)。
[0060] 2) 10. 8g2-2加入30mL丙酮溶解，再加入L1MNaHC03水溶液70mL后室温搅拌2 小时（充分搅拌，除去原料中结合的HC1)，冰水浴下缓慢加入溶有3. 93g(0. 03mol)丙酸酐 的丙酮溶液50mL，反应1小时；反应结束后2N盐酸调pH至3. 0左右，加入DCMIOOmL萃取 两次，取有机相50°C，0. 03MPa旋转蒸发得12. 4g粘稠固体，进行硅胶柱层析（洗脱剂比例： DCM-DCM:MeOH= 50:1-DCM:Me0H= 30:1)得到 1(^(0.0228111〇1)2-3(^-丙酰4-芴甲氧 羰基-Ν' -甲基-L-赖氨酸，C25H3QN205)。
[0061] 3) 10g2-3加入7〇mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF)和四氢呋喃（THF)溶 解后加入6mL(0.061mol)哌啶，常温搅拌过夜，TLC确认反应结束；油泵减压蒸馏蒸 干（0. 88kPa)溶剂后得8g混合产物，进行硅胶柱层析（洗脱剂比例：DCM-DCM:MeOH= 50:1-DCM:MeOH= 30:1)，得到 3. 4g(0. 0147mol)纯的酯化产物；加 0. 585g氢氧化钠、 35mL7jC，35mL甲醇进行水解，冰水浴下反应2小时，酯化产物完全水解后用2NHC1调pH至 3. 0。50°C，0. 03MPa旋干溶剂，再加入20mL乙醇溶解产物，过滤后滤液旋干，得最终产物 2-4(Lys(me-prop) -0H，Ν' -丙酰-Ν' -甲基-L-赖氨酸C1QH2QN203) 2. 6g。
[0062] 2、单甲基丙酰化赖氨酸化合物与载体蛋白KLH偶联制备免疫原
[0063] (1)lOmgKLH溶于lmLMES缓冲液中；
[0064] (2)分别加入0· 4mg的EDC与1.lmgSulfo-NHS;充分混匀，室温反应15分钟；
[0065] (3)随后加入1. 4μLβ-巯基乙醇，反应lOmin后用PBS将pH调至7. 4 ;
[0066](4) 2mgLys(me-prop)化合物溶于PBS后，加至步骤（3)中活化后的KLH溶液中， 充分混匀，室温反应2小时；
[0067] (5)随后加入50mMTris反应15min，PBS溶液中4°C透析过夜。
[0068] 3、动物免疫程序
[0069] 1)8周龄新西兰大白兔，皮下多点注射；
[0070] 2)第一次免疫：取500μL浓度为0. 8mg/ml的KLH偶联的小分子免疫原与同体积 完全福氏佐剂混合乳化，背部皮下多点免疫；
[0071] 3)3周后，取500μL浓度为0. 4mg/ml的免KLH偶联的小分子疫原与同体积不完全 福氏佐剂混合乳化后，背部皮下多点注射；
[0072] 4)每隔2周，按步骤3的剂量与方法加强免疫一次；
[0073] 5)第4次免疫后10天取1ml血清，用ELISA方法检测血清滴度。若血清滴度大于 3万，即通过心脏采血。若血清滴度不合格，则继续重复步骤4,直至血清滴度大于3万。
[0074] 4、多克隆抗体纯化
[0075] ProteinA预纯化：
[0076] 1)滴度大于3万的血清10mL10000r/min离心10分钟，吸取上清用0. 45μm微孔 滤膜过滤；
[0077] 2) 3mlProteinA树脂室温平衡1小时，4倍柱体积的磷酸盐缓冲液（PBS，ρΗ7· 2) 清洗树脂；
[0078] 3)过滤后的血清20ml上样到含有ProteinΑ树脂的柱子中，并与ProteinΑ柱 子室温孵育90min后，静置15min;
[0079] 4)分别用10倍柱体积的清洗缓冲液A洗1次，15倍柱体积PBS洗柱子1次；
[0080] 5) 5倍柱体积的洗脱Buffer洗脱，随后加入中和缓冲液，4°CPBS透析过夜；
[0081] 6)超滤IgG至浓度为 5-10mg/ml。
[0082] 抗原多肽偶联柱子制备
[0083] 1)室温平衡SulfoLinkCouplingResinl小时，混匀后吸取5ml于层析空柱中，4 倍柱体积的偶联缓冲液清洗两次；
[0084] 2)称取5mg抗原多肽，分别溶于偶联缓冲液中，加入SulfoLinkCouplingResin 层析柱柱中混匀，室温孵育15分钟；
[0085] 3)静置30分钟，15倍柱体积的偶联缓冲液洗柱子；
[0086] 4)加入1倍柱体积封闭缓冲液，室温孵育15分钟后，6倍柱体积清洗缓冲液B清 洗柱子；
[0087] 5)分别获得含有多肽1偶联柱子和多肽2偶联柱子。
[0088] 抗原多肽亲和纯化
[0089] 将5mgProteinA预纯化超滤后得到的IgG加入至抗原多肽偶联柱子中，室温孵 育2小时；舍弃流出液后，分别用5倍柱体积的清洗缓冲液和10倍柱体积的PBS清洗柱子， 然后按以下步骤活动纯化抗体：
[0090] 1) 4倍柱体积洗脱缓冲液洗脱；
[0091] 2)洗脱液中加入中和缓冲液，透析袋中于4°CPBS透析过夜；
[0092] 3)超滤IgG至浓度为 5-10mg/ml;
[0093] 4)将上述超滤后的IgG加入至多肽2偶联柱子中，室温孵育30分钟，收集流出液， 即为纯化好的抗体。
[0094] 5、斑点印迹（DotBlot)检测：
[0095] 1)将表3与表4中所列的多肽溶于水中，配置成初始浓度为100ng/μL的多肽溶 液；
[0096] 2)裁剪合适大小的PVDF膜，无水甲醇处理大约40秒，去离子水中漂洗3次，自然 干燥2分钟；
[0097] 3)将初始浓度为100ng/μL的多肽溶液进一步分别稀释为20ng/μL与4ng/μL。 然后依次点样，1μ1/点，干燥10分钟后放入六孔板中；
[0098] 4) 5%脱脂奶粉室温封闭60分钟，TBST洗液漂洗两次，5分钟/次；
[0099] 5)用5 %脱脂奶粉稀释抗体，室温孵育1小时，用TBST洗液漂洗三次，10分钟/ 次；
[0100] 6)用5 %脱脂奶粉稀释羊抗兔HRP标记抗体，室温45分钟，TBST洗液漂洗三次， 10分钟/次；
[0101] 7)将化学发光显色液均匀铺于膜上，孵育5分钟后曝光，结果见图1与图2。
[0102] 表3 :图1和图4斑点印迹实验中所用多肽的序列（Κ*表示经过修饰的赖氨酸，其 中X为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸）
[0103]
[0104]
[0105] 表4 :图2和图5斑点印迹实验中所用多肽的序列（K*表示经过修饰的赖氨酸，其 中X为19中常见氨基酸中除半胱氨酸之外的任意一氨基酸）
[0106]
[0107] 斑点印迹检测表明，通过本发明设计的单甲基化丙酰化赖氨酸小分子作为抗原获 得的多克隆抗体可以