物Primer L1μ1;
[0107]DNA模板Xμ1;
[010引灭菌蒸馈水20μ1---上述总体积；
[0109] PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0110] 图1为PCR电泳图，1、4、7为11778位点扩增片段；2、5、8为11484位点扩增片段； 3、6、9为3460位点扩增片段。
[0111] 实施例2
[0112] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0113]DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0114] 1)加 220μ1BufferBL，震荡混合，于 70°C解育 10 分钟；
[011引。加220μ1无水乙醇震荡混合约20秒；
[011引 3) 12000巧m离屯、1分钟；
[0117] 4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0118] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[011引 6)12000巧m离屯、2分钟；
[0120] 7)加入 700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2 分钟；
[0121] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2分 钟；
[012引 9)弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0123] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0124] PCR扩增
[0125] PCR反应体系：
[0126] 10XPCRBuffer2μ1 ；
[0127]HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
[0128]dNTPmix2μ1 ；
[0129]上游引物PrimerU1μ1 ;
[0130]下游引物PrimerL1μ1 ;
[0131]DNA模板Xμ1 ;
[0132] 灭菌蒸馈水20μ1 ---上述总体积；
[0133]PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0134]PCR产物纯化
[013引 每管内加入100μΙPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min;
[0136]弃收集管内液体，加入 700μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[0137]弃收集管内液体，加入 400μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[013引 弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0139] 柱内加入30μ1 70°C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0140] 测序反应
[014"反应体系：0. 8μ1Bi曲ye+1.5ylBi曲yeSeqBuffer+3yl引物+1μ1PCR纯 化产物+3. 5μ1 (1地20;
[0142] 测序PCR热循环条件：
[0143] 1)变性的条件，96°ClOsec;
[0144] 8)退火的条件，（首先96°ClOsec，其次50°C5sec，然后60°C4min)X25个循环；
[014引 9)延伸的条件，60°C4min;
[0146] 10)4°C保溫；
[0147] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[014引测序产物纯化
[014引 10μ1反应体系，96孔板，酒精法；
[0150] 1)每管加入100μ1 100%酒精，然后震荡混匀，室溫放置15min;
[0151] 2) 10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[015引 3)每管加入100μl70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[015引 4)室溫挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DNA;
[0154] 5) 95°C变性 5min，4°C保溫 4min，加样上机；
[015引 7)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0156] PCR检测，包括：
[0157] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔.
[0158] 在LE邸R氏基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物；
[0159] 所述引物是G11778A、T14484C和G3460A;
[0160] 所述引物G11778A的sense为：
[0161] 5' -TCAATCAGCCACATAGC-3',
[0162] 所述引物G11778A的antisense为：
[0163] 5' -GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3',
[0164] 所述T14484C的sense为：
[01巧]5' -CAGGGGTTGAGGTCTTG-3'，
[0166] 所述T14484C的antisense为：
[0167] 日'-CGCCCATAATCATACAAA-3' ；
[0168] 所述G3460A的sense为：
[0169] 5'-CTAATGCTTACCGAACGA-3' ，
[0170] 所述G3460A的antisense为：
[0171] 5' -TGATGGCTAGGGTGACTT-3'；
[017引所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[0173] 所述目的片段的获取包括：W上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-2化g/μ1，作为检 测阴性对照用；
[0174] 2) 25μ1反应体系检测：
[0175] PmmixTaqPGRMasterMIX 12.5μL DNA.模板 i-iOng/μΙ PrimerU 终浓度为400nM PrimerL 终浓度为4(妨?Μ 灾菌蔡傭水 Upto25μ1
[0176] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0177] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0178] 所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中94°C预变性3min，94°C变性30sec， 51°C退火30sec，72°C延伸30sec，共循环35次。
[0179] 所述引物G11778A的扩增产物序列是：
[0180]
[0185] 上述扩增产物序列中字体加粗的位置为突变位点。
[0186] 实施例3
[0187] 样本处理：取外周血2ml于邸TA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0188]DNA提取，取220μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0189] 1)加 220μ1Buffer6以震荡混合，于70°C解育10分钟；
[0190] 2)加220 μ 1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0191] 3) 12000巧m离屯、1 分钟；
[019引 4)取上清转入收集柱中，12000巧m离屯、2分钟；
[0193] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1皿solution,室溫放置5分钟；
[0194]6) 12000巧m离屯、2 分钟；
[019引 7)加入 700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2 分钟；
[0196] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer, 12000巧m离屯、2分 钟；
[0197] 9)弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0198] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离屯、管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 溫放置l-2min，12000巧m离屯、2分钟，滤液即为模板DNA;
[0199] PCR扩增
[0200] PCR反应体系：
[020" 10XPCRBuffer2μ1 ;
[020引HotStarTaqDNAPolymerase按kit标准调整；
[020引dNTP mix2μ1;
[0204]上游引物PrimerU1μ1;
[0205]下游引物PrimerL1μ1;
[0206]DNA模板Xμ1;
[0207] 灭菌蒸馈水20μ1 ---上述总体积；
[0208]PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0209]PCR产物纯化
[0210] 每管内加入100μΙPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000巧m离屯、2min ;
[0211] 弃收集管内液体，加入 700μ1washingbuffer, 12000巧m离屯、2min;
[021引 弃收集管内液体，加入400μ1washingbuffer,12000巧m离屯、2min;
[021引弃收集管内液体，12000巧m离屯、2min;
[0214] 柱内加入30μ1 70 °C预热洗脱液，12000巧m离屯、3min;
[0215] 测序反应
[021引 反应体系：0.8μ1Bi曲ye+1. 5μ1Bi曲yeSeqBuffer+3μ1 引物+1μ1PCR纯 化产物 +3. 5μ1dd&0 ;
[0217]测序PCR热循环条件：
[021引 1)变性的条件，96°ClOsec;
[0219] 11)退火的条件，（首先 96°ClOsec，其次 50°C5sec，然后 60°C4min)X25 个循环；
[0220] 12)延伸的条件，60°C4min;
[0221] 13)4°C保溫；
[0222] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的溫度后开始计算；
[0223] 测序产物纯化
[0224] 10μ1反应体系，96孔板，EDTA法；
[022引 1)每管加入1μ1 125mM邸ΤΑ到管底，室溫放置15min;
[022引 2)10°C，4000巧m离屯、30min，马上倒置，1200巧m离屯、Imin;
[0227] 3)每管加入100μΙ70%酒精，离屯、15min;5°C，3600巧m离屯、30min，马上倒置， 1200巧m离屯、Imin;
[022引 4)室溫挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di化rmamide溶解DNA;
[0229] 5) 95°C变性 5min，4°C保溫 4min，加样上机；
[0230]8)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[023U PCR检测，包括：
[0232] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔；
[0233] 在LE邸R氏基因突变位点两端设计Ξ对特异性引物；
[0234]所述引物是G11778A、T14484C和G