G11778A、T14484C和G3460A引物对检测，PCR扩增。 将扩增产物使用ABI3500DX进行测序分析，将测序结果与NCBIBLAST进行比对分析，结果 显示，与报道的目的基因序列完全一致。如图2-4所示，为利用本发明提供的试剂盒对正常 人G11778A、T14484C和G3460A的检测结果，本发明利用3对特异性引物同时对患者的可能 的突变位点进行检测，使用该方法能保证95%W上的疾病检出率。
[0332] 本发明直接W全血样作PCR的DNA模板，设计并合成特异性PCR引物，扩增产物并 进行测序，可W直接检测L册N患者线粒体DNA3个原发性致病突变位点位点的具体情况， 具有较高的特异性和准确性。
[0333] 上述说明示出并描述了本申请的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本申请 并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、 修改和环境，并能够在本文所述申请构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识 进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本申请的精神和范围，则都应在本申 请所附权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测LEBER氏致病基因突变的方法，不用于疾病的诊断和治疗，其特征在于，其 包括如下实现步骤： 样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存； DNA提取，取220 μ 1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括： 1) 加 220 μ 1 Buffer BL，震荡混合，于 70°C孵育 lOmin ; 2) 加220 μ 1无水乙醇震荡混合约20秒； 3) 12000rpm离心1分钟； 4) 取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟； 5) 将收集柱置一个新的收集管上，加入500 μ 1 HB solution，室温放置5分钟； 6) 12000rpm离心2分钟； 7) 加入 700 μ 1 wash Buffer，12000rpm 离心 2 分钟； 8) 将收集柱置一个新的收集管上，加入700 μ 1 wash Buffer，12000rpm离心2min ; 9) 弃收集管内液体，12000rpm离心2min ; 10) 将收集柱放入一个新的1. 5ml离心管内，加入50 μ 1 70°C预热的洗脱液，室温放 置l-2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA ; PCR扩增 PCR反应体系： 10XPCR Buffer 2 μ 1 ； HotStarTaq DNA Polymerase 按 kit 标准调整； dNTP mix 2 μ 1 ; 上游引物PrimerU 1 μ 1 ; 下游引物Primer L 1 μ 1 ; DNA 模板 x μ 1 ; 灭菌蒸馏水20 μ 1 上述总体积；PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果； PCR产物纯化 每管内加入100 μ 1 PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min ; 弃收集管内液体，加入700 μ 1 washing buffer，12000rpm离心2min ; 弃收集管内液体，加入400 μ 1 washing buffer，12000rpm离心2min ; 弃收集管内液体，12000rpm离心2min ; 柱内加入30 μ 1 70°C预热洗脱液，12000rpm离心3min ; 测序反应 反应体系：〇·8μ1 BigDye+1.5yl BigDye Seq Buffer+3yl 引物+1μ1 PCR 纯化产 物 +3. 5 μ 1 ddH20 ; 测序PCR热循环条件： 1) 变性的条件，96°C lOsec ; 2) 退火的条件，（首先96°C lOsec，其次50°C 5sec，然后60°C 4min) X 25个循环； 3) 延伸的条件，60°C 4min ; 4) 4 C保温； 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算； 测序产物纯化 10 μ 1反应体系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法； 1) 每管加入100μΙ 100%酒精，或每管加入ΙμL 125mMEDTA到管底，或每管加入 1 μ 1 3M NaAc到管底，然后震荡混匀，室温放置15min ; 2) 10°C，4000rpm 离心 30min，马上倒置，1200rpm 离心 lmin ; 3) 每管加入100 μ 1 70 %酒精，离心15min ;5 °C，3600rpm离心30min，马上倒置， 1200rpm 离心 lmin ; 4) 室温挥发净酒精，加入10 μ 1 Hi-Di Formamide溶解DNA ; 5) 95°C变性5min，4°C保温4min，加样上机； 6) 测序纯化：ABI Bigdye XT erminator purification kit ; PCR检测，包括： 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对照和 样本均采用复孔； 在LEBER氏基因突变位点两端设计三对特异性引物； 所述引物是 G11778A、T14484C 和 G3460A ; 所述引物G11778A的sense为： 5,-TCAATCAGCCACATAGC-3,， 所述引物G11778A的antisense为： 5'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3' ， 所述 T14484C 的 sense 为： 5'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3' ， 所述 T14484C 的 antisense 为： 5,-CGCCCATAATCATACAAA-3，； 所述G3460A的sense为： 5'-CTAATGCTTACCGAACGA-3' ， 所述 G3460A 的 antisense 为： 5,-TGATGGCTAGGGTGACTT-3，； 所述引物PCR扩增出目的片段模板； 所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条带单 一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10_20ng/ μ 1，作为检测阴 性对照用； 2) 25 μ 1反应体系检测：混合均匀；所有样本混合完后，将ABI Veriti Dx PCR系统仪器中进行程序性检测； 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩 增仪中94°C预变性3min，94°C变性30sec，51°C退火30sec，72°C延伸30sec，共循环35次。3. -种检测LEBER氏致病基因突变的引物，其特征在于，所述引物序列包括： 引物是G11778A SEQ ID N0:15'-TCAATCAGCCACATAGC-3' SEQ ID N0:25'-GAGTTCTCCCAGTAGGTTA-3' ；退火温度为 51°C 引物是T14484C SEQ ID N0:35'-CAGGGGTTGAGGTCTTG-3' SEQ ID N0:45'-CGCCCATAATCATACAAA-3' ；退火温度为 51°C 引物是G3460A SEQ ID N0:55'-CTAATGCTTACCGAACGA-3' SEQ ID N0:65'-TGATGGCTAGGGTGACTT-3' ；退火温度为 51°C。4. 根据权利要求3所述的检测LEBER氏致病基因突变的引物，其特征在于， 所述引物G11778A的扩增产物序列是： Tcaatcagcc acatagccct cgtagtaaca gccattctca tccaaacccc ctgaagcttc accggcgcag tcattctcat aatcgcccac gggcttacat cctcattact attctgccta gcaaactcaa actacgaacg cactcacagt cgcatcataa tcctctctca aggacttcaa actctactcc cactaatagc tttttgatga cttctagcaa gcctcgctaa cctcgcctta ccccccacta ttaacctact gggagaactc 所述引物T14484C的扩增产物序列是： caggggttga ggtcttggtg agtgttttag tggggttagc gatggaggta ggattggtgc tgtgggtgaa agagtatgat ggggtggtgg ttgtggtaaa ctttaatagt gtaggaagct gaataattta tgaaggagag gggtcagggt tgattcggga ggatcctatt ggtgcggggg ctttgtatga ttatgggcg 所述引物G3460A的扩增产物序列是： Ctaatgctta ccgaacgaaa aattctaggc tatatacaac tacgcaaagg ccccaacgtt gtaggcccct acgggctact acaacccttc gctgacgcca taaaactctt caccaaagag cccctaaaac ccgccacatc taccatcacc ctctacatca ccgccccgac cttagctctc accatcgctc ttctactatg aacccccctc cccataccca accccctggt caacctcaac ctaggcctcc tatttattct agccacctct agcctagccg tttactcaat cctctgatca gggtgagcat caaactcaaa ctacgccctg atcggcgcac tgcgagcagt agcccaaaca atctcatatg aagtcaccct agccatca〇5. -种检测LEBER氏致病基因突变的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括有权利要求3 所述的引物。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1)序列如SEQ ID NO: 1、 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6 所示的引物；2)PCR 反应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的浓度为10 μ mol/L。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由Premix Taq PCR MasterMIX缓冲液，模板DNA，Primer U，Primer L，灭菌蒸馏水组成，各组份反应时终浓度 为：9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述Premix Taq PCR MasterMIX缓冲 液包括Tris. cl，氯化钾，硫酸铵，氯化镁，-20°C下pH值在8. 0-9. 0之间。
【专利摘要】本申请公开了一种检测LEBER氏致病基因突变的方法，及其引物、试剂盒，所述检测方法包括：样本处理，DNA提取，PCR扩增，PCR产物电泳，PCR产物纯化，测序。所述引物序列如：SEQ？ID？NO:1，SEQ？ID？NO:2，SEQ？ID？NO:3，SEQ？ID？NO:4，SEQ？ID？NO:5和SEQ？ID？NO:6所示，所述试剂盒包括有上述引物。本发明的优点是：解决了现有技术中进行LEBER氏致病基因突变检测程序繁琐、费用昂贵、费时、易污染和灵敏度低等问题，尤其是提供了病理组织之外的非创伤性如血清或血浆等检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105331719
【申请号】CN201510850011
【发明人】王培昌, 王丽凤
【申请人】首都医科大学宣武医院
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月27日